摘要
为了研究VHL(von Hippel-Lindau)抑制剂对帕金森病(Parkinson′s disease,PD)秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C. elegans,简称线虫)模型的影响,采用鱼藤酮诱导PD线虫模型,并使用VHL抑制剂VH298进行干预。以不同浓度的鱼藤酮对转基因线虫zcIs9; otIs181进行诱导损伤,考察线虫死亡、多巴胺能神经元退化和线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response,mito-UPR)情况;采用不同浓度的VH298干预PD线虫模型,考察线虫死亡和多巴胺能神经元退化情况,同时对线虫运动行为如头部摆动频率、身体弯曲频率以及觅食行为进行分析。结果显示:不同浓度的鱼藤酮对转基因线虫zcIs9; otIs181具有不同程度的致死毒性和神经毒性,并且引起线虫mito-UPR异常;VH298能够减少鱼藤酮所致PD线虫模型的异常死亡和多巴胺能神经元退化情况,同时能够缓解线虫模型头部摆动频率、身体弯曲频率和觅食行为异常情况。实验结果提示,鱼藤酮可通过诱导转基因线虫zcIs9; otIs181线粒体损伤,破坏线粒体稳态,进而导致多巴胺能神经元退化及线虫死亡;VHL抑制剂VH298能改善鱼藤酮所致PD线虫模型死亡现象,并且VHL抑制剂VH298通过减少多巴胺能神经元退化,进而缓解PD线虫模型运动行为异常情况。
帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一种与年龄相关的神经退行性疾病,目前全球有600多万患者,随着世界人口老龄化加剧,PD患者数量将逐年增
本课题组于前期研究中建立了转基因线虫zcIs9; otIs181,发现线粒体复合体Ⅰ亚基NDUF7突变导致ADE多巴胺能神经元特异性退化,出现PD样症状,同时基于该线虫模型,进一步研究发现线虫VHL-1功能缺失能显著缓解ADE多巴胺能神经元退化情
鱼藤酮(纯度:98.12%)、VHL抑制剂VH298(纯度:99.83%,美国MCE公司);胆固醇(上海麦克林生化科技有限公司);琼脂粉、酵母粉、蛋白胨(美国Oxoid公司);柠檬酸钾(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);次氯酸钠溶液(国药集团化学试剂有限公司);其他试剂均为市售分析纯。
NGM培养基、M9溶液、S培养基、LB液体培养基、线虫裂解液等溶液按照文献[
高速冷冻离心机、低温培养箱(美国Thermo公司);体视显微镜、荧光体视显微镜(日本Nikon公司);倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);高压灭菌锅(日本Panasonic公司)。
使用M9溶液1 mL将处于产卵期的线虫从直径为6 cm的NGM平板上冲洗下来,加至1.5 mL EP管中,2 000 r/min离心30 s,吸除上清液700 μL,再加入线虫裂解液700 μL,混匀5 min左右, 4 000 r/min离心30 s,吸上清液至管内剩余液体约100 μL,再加入M9溶液900 μL,轻吹混匀,重复清洗3次后,4 000 r/min离心30 s,吸除上清液900 μL,轻吹混匀剩下的虫卵溶液,吸至未接种OP50大肠埃希菌的NGM平板上,放置20 ℃低温培养箱培养,次日即可得到L1期线虫幼虫。
将同步化处理得到的L1期线虫接种至涂布有OP50大肠埃希菌的NGM培养基上,放置低温培养箱生长1 d后进行实验。鱼藤酮诱导PD线虫模型试验采用96孔板进行,每孔溶液终体积为100 μL,设置鱼藤酮最终浓度为8.0, 4.0, 2.0, 1.0, 0.5, 0 μmol/L共6组,每组4个孔,用S培养基重悬OP50大肠埃希菌,保证每孔加入10 mg/μL OP50大肠埃希菌5 μL,之后加入含有20 ~ 30只幼虫的S培养基 10 μL,次日观察并记录各组线虫死亡情况,并且观察各组生长至L4期线虫的多巴胺能神经元退化情况。对于判断线虫是否死亡,在体视显微镜下观察,当线虫身体呈现僵直状态且无运动行为时,用铂丝针刺激其身体,无反应的线虫则视为死亡。对于观察线虫多巴胺能神经元退化情况或mito-UPR情况,滴25 mmol/L左旋咪唑溶液5 μL于含有3%琼脂糖垫的载玻片上,将处理后的线虫放置溶液中进行麻醉,之后将盖玻片轻轻压住线虫,于荧光体视显微镜或荧光倒置显微镜下观察头部ADE多巴胺能神经元退化情况或mito-UPR激活情况。对于判断线虫ADE多巴胺能神经元是否退化,在正常情况下,线虫头部ADE多巴胺能神经元mCherry红色荧光斑点清晰可见,而当暴露于一定浓度的鱼藤酮后,线虫ADE多巴胺能神经元mCherry红色荧光斑点缺失则视为ADE多巴胺能神经元退化。在正常情况下,线虫虫体GFP绿色荧光微弱,而当mito-UPR激活后,线虫虫体GFP绿色荧光明显增强。
抑制剂干预试验采用96孔板进行,每孔溶液终体积100 μL,每孔20 ~ 30只L1期幼虫,设置抑制剂VH298终浓度为400,200,100 μmol/L进行提前干预,每组4个孔,1 d后使用M9溶液清洗线虫3次,再将线虫加入新鲜配制的含有鱼藤酮和不同浓度VH298的96孔板中进行共孵育,1 d后使用M9溶液清洗线虫3次,将线虫转移至NGM培养基上进行各项指标分析。观察线虫死亡和多巴胺能神经元退化情况的方法,参见“2.3”项。
抑制剂VH298干预PD线虫模型参见“2.4”项。在未接种OP50大肠埃希菌的NGM培养基上滴加M9溶液80 μL,用铂丝针挑取处理后的线虫置于M9溶液中,待其恢复1 min后,在体视显微镜下观察并记录线虫在1 min内头部摆动的次数(线虫头部从一侧摆向另一侧又摆回来的次数)。
抑制剂VH298干预PD线虫模型见“2.4”项。在直径为9 cm的未接种OP50大肠埃希菌的NGM培养基中央滴大肠埃希菌OP50菌液5 μL,形成直径为1 cm的圆形菌苔,将线虫放入距离培养皿中心位置4 cm处,每个培养皿放置20条。分别记录4,12,24 h后接触菌落的线虫数,计算接触菌落线虫占线虫总数的比例。
本研究选用带有zcIs9和otIs181两个遗传标记的转基因线虫,其中zcIs9[hsp-60p∷GFP]用于监测线虫mito-UPR,otIs181[dat-1p∷mCherry + ttx-3p∷mCherry]用于标记4对多巴胺能神经元和1对非多巴胺能神经元AIY。转基因线虫zcIs9; otIs181同步化处理后生长2 d,采用不同浓度的鱼藤酮损伤线虫,次日在体视显微镜下观察并记录各组线虫死亡情况。结果如

Figure 1 Evaluation of death in C. elegans strain with zcIs9; otIs181 with exposure to different concentrations of rotenone ()
**P < 0.01
转基因线虫zcIs9; otIs181同步化处理后生长2 d,采用不同浓度的鱼藤酮损伤线虫,1 d后在荧光体视显微镜下观察并记录各组L4期线虫多巴胺能神经元退化和mito-UPR激活情况。结果如

Figure 2 Evaluation of neurons and mito-UPR in C. elegans strain with zcIs9; otIs181 with exposure to different concentrations of rotenone ()
A: Quantitative analysis of ADE neurodegeneration; B: Representative fluorescence images showing mito-UPR (arrows)(Scale bar: 100 μm)
采用不同浓度的VHL抑制剂VH298(400,200和100 μmol/L)进行提前干预,次日采用终浓度为2.0 μmol/L鱼藤酮与不同浓度的VH298共同孵育线虫,1 d后在体视显微镜下观察并记录各组线虫死亡情况。结果如

Figure 3 Effects of VHL inhibitor VH298 on death in C. elegans strain with zcIs9; otIs181 with exposure to 2.0 μmol/L rotenone ()
**P < 0.01
首先采用不同浓度的VHL抑制剂VH298(400,200和100 μmol/L)进行提前干预,次日采用终浓度为2.0 μmol/L鱼藤酮与不同浓度的VH298共同孵育线虫,1 d后在体视显微镜下观察并记录各组L4期线虫多巴胺能神经元退化情况。结果如

Figure 4 Effects of VHL inhibitor on neurons in C. elegans strain with zcIs9; otIs181 with exposure to 2.0 μmol/L rotenone ()
A: Quantitative analysis of ADE neurodegeneration; B: Representative whole-body fluorescence images (Upper column; scale bar: 200 μm) and enlarged images (Lower column; scale bar: 50 μm) showing ADE neurons (arrows) in zcIs9; otIs181 animals
采用VHL抑制剂VH298(400,200和100 μmol/L)和鱼藤酮(2.0 μmol/L)处理线虫,体视显微镜下观察L4期线虫头部摆动、身体弯曲情况。结果如

Figure 5 Effects of VHL inhibitor VH298 on head thrashes and body bends in C. elegans strain with zcIs9; otIs181 with exposure to 2.0 μmol/L rotenone ()
A: Quantitative analysis of head thrashes; B: Quantitative analysis of body bends
采用VHL抑制剂VH298(400,200和100 μmol/L)和鱼藤酮(2.0 μmol/L)处理线虫,体视显微镜下观察线虫觅食情况。结果如

Figure 6 Effects of VHL inhibitor on foraging behavior in C. elegans strain with zcIs9; otIs181 with exposure to 2.0 μmol/L rotenone ()
A:Diagram of foraging behavior; B: Quantitative analysis of attainment level
本研究采用神经毒性剂鱼藤酮处理转基因线虫zcIs9; otIs181,该转基因线虫出现异常死亡、神经元异常退化以及异常激活mito-UPR的情况,模拟了类PD样症状如多巴胺能神经元丢失和运动障碍;通过VHL抑制剂VH298干预PD线虫模型,发现VH298能促进PD线虫模型存活,缓解ADE多巴能神经元退化情况,并且改善PD线虫模型运动障碍如头部摆动频率和身体弯曲频率以及多巴胺依赖性行为如觅食行为异常等情况。综上,鱼藤酮可能通过引起转基因线虫zcIs9; otIs181线粒体损伤,导致线粒体稳态失衡,进而诱发线虫异常死亡及神经元退化;VHL抑制剂VH298能减少鱼藤酮导致的转基因线虫zcIs9; otIs181异常死亡;可通过保护多巴胺能神经元进而改善由多巴胺能神经元丢失所导致的运动行为异常和觅食行为异常。本研究为VHL抑制剂治疗帕金森病奠定了一定的理论基础。
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