摘要
采用色谱-质谱联用技术鉴定劳拉西泮片中的有关物质。采用InertSustain C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%冰醋酸-20 mmol/L乙酸铵缓冲溶液为流动相梯度洗脱，对劳拉西泮片有关物质进行分离，电喷雾正离子化-四极杆-飞行时间串联质谱（ESI-Q-TOF/MS）高分辨测定各有关物质母离子及其子离子的准确质量和元素组成，通过光谱解析鉴定了有关物质的结构。在所建立的分析条件下，劳拉西泮及其有关物质分离良好，检测并鉴定出劳拉西泮片及其强制降解试验样品中22个含量大于0.1%的主要有关物质，其中5个为美国药典或欧洲药典规定的已知杂质，而其他均为本研究首次鉴定出的未知有关物质。色谱-质谱联用技术能有效地分离鉴定劳拉西泮片中的有关物质，可为其质量控制提供参考依据。
劳拉西泮［7-氯-5-（2-氯苯基）-1，3-二氢-3-羟基-2H-1，4-苯并二氮杂䓬2-酮，lorazepam，合成路线见
Figure 1 Typical synthetic routes for lorazepam
虽然劳拉西泮原料药及其制剂的有关物质已被多国药
Figure 2 Lorazepam known related substances listed in EP and USP
本研究以劳拉西泮临床常用片剂为对象，建立了适用于劳拉西泮有关物质检查的色谱-质谱联用分析方法，通过高分辨Q-TOF/MS测定了劳拉西泮有关物质的准确相对分子质量及分子式，结合MS/MS的子离子特征，综合解析鉴定了各有关物质的结构，可为劳拉西泮的质量控制提供参考依据。
劳拉西泮片（湖南洞庭湖药业股份有限公司，批号B2006043），工艺有关物质对照品（自制，杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和EP10有关物质B（EP-B），
Figure 3 Chemical structures of lorazepam process related substances
InertSustain C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相A相为0.1%冰醋酸-20 mmol/L乙酸铵缓冲溶液，B相为乙腈，线性梯度洗脱（A∶B）： 0 min（70∶30）→40 min（10∶90）→60 min（10∶90）→61 min（70∶30）→70 min（70∶30），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长230 nm，进样量20 μL。
电喷雾正离子化，高分辨Q-TOF/MS测定，NaI溶液（400 μg/mL）准确质量校正。喷雾电压4.0 kV，雾化气压力230 kPa，流量3 L/min，接口温度300 ℃，加热气流量10 L/min，干燥气流量10 L/min，氩气CID碰撞能量5 ~ 45 eV，扫描范围m/z 50 ~ 1 500。
供试品溶液：取劳拉西泮片粉适量（约相当于劳拉西泮2 mg），精密称定，置10 mL量瓶中，加乙腈适量，超声使劳拉西泮溶解，再以流动相稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm有机系滤膜过滤，取续滤液即得质量浓度为0.2 mg/mL的供试品溶液。精密量取上述溶液适量，加流动相定量稀释，配制0.1%的自身对照溶液。
对照品溶液：取工艺有关物质对照品（杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和EP-B）各适量，分别精密称定，加适量乙腈溶解，并用流动相定量稀释制成质量浓度均约为0.2 μg/mL的混合溶液，作为有关物质的对照品溶液。
强制降解试验溶液：取劳拉西泮片粉适量（约相当于劳拉西泮2 mg），加1.0 mol/L盐酸1 mL并于40 ℃水浴放置90 min，或加0.1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL并于30 ℃水浴放置4 h，或加30%过氧化氢溶液1 mL并于40 ℃水浴放置12 h，或于90 ℃烘箱中放置4 h，或加水1 mL并于光照4 500 lx放置10 d分别处理。放冷（酸碱处理溶液先中和）后，分别加乙腈适量，振摇使劳拉西泮溶解，并加流动相稀释至约10 mL，以0.45 μm有机系滤膜过滤，取续滤液作为劳拉西泮质量浓度约为0.2 mg/mL的强制降解试验溶液。并以溶样溶剂为空白。
建立的挥发性流动相HPLC分析法，适用于劳拉西泮片有关物质检查和联用质谱鉴定。
Figure 4 HPLC chromatograms of lorazepam tablets and its stressed test solutions
API: Lorazepam; 1-22: Related substances 1-22.a: Blank solvent; b: Mixture of reference related substances; c: 0.1% Self-reference; d: Test sample; e: Wet photolytic; f: Alkaline; g: Acidic; h: Dry heat; i: Oxidation
强制降解试验表明（
采用高分辨Q-TOF/MS测定各有关物质的母离子及子离子的准确质量和元素组成，以及它们的二级质谱特征碎片，并通过与劳拉西泮和已知有关物质的质谱特征的对比分析，鉴定各主要有关物质的结构。结果见
Pr: Process related substance;Dr: Degradation related substance
Figure 5 Chemical structures of lorazepam and its related substances 1-22
Figure 6 MS/MS spectra of lorazepam and its related substances [M+H
API (m/z 321); 1 (m/z 592); 2 (m/z 576); 3 (m/z 319); 4/6/7/8 (m/z 337); 5 (m/z 321); 9 (m/z 338); 10 (m/z 325); 11 (m/z 291); 12 (m/z 321); 13 (m/z 307); 14 (m/z 305); 15 (m/z 330); 16 (m/z 275); 17 (m/z 266); 18 (m/z 623); 19 (m/z 604); 20 (m/z 549); 21/22 (m/z 906)
通过有关物质HPLC定位、DAD共轭体系（
Figure 7 DAD spectra of lorazepam and its related substances
Figure 8 MS/MS fragmentation pathways of [M+H
劳拉西泮及已知有关物质紫外共轭体系规律如下：（1） 劳拉西泮、对照品Ⅰ和EP-B及有关物质5和12母核结构为苯并二氮杂䓬环，λmax在230 nm左右；（2）有关物质3和14母核结构为苯并哌嗪环，由原苯并二氮杂䓬环酰胺基水解开环重排形成，共轭体系无明显差异，λmax也在230 nm左右；（3）对照品Ⅱ和Ⅲ及有关物质17母核结构为二苯酮，由原苯并二氮杂䓬环亚胺基水解开环并氧化形成，共轭体系有较大差异，除λmax在230 nm左右外，250 nm处有明显的肩峰。
劳拉西泮及已知有关物质MS/MS裂解规律如下：（1）劳拉西泮及其有关物质12和14的母离子中，苯并二氮杂䓬环或苯并哌嗪环上的羟基脱水，生成质量数少18的特征碎片离子；（2）劳拉西泮及其有关物质5和12的母离子中，苯并二氮杂䓬环上的羟基脱水和羰基脱落，生成质量数少46的特征碎片离子；（3）劳拉西泮的上述特征碎片离子及其有关物质5和17的母离子中，苯环上可脱去HCl与邻苯形成五元环，生成质量数少36的特征碎片离子。
根据劳拉西泮及已知有关物质的这些结构特征，并结合已有报道文献分
对于各未知有关物质，根据其HPLC保留行为、DAD及质谱特征、及其与劳拉西泮或已知有关物质的差异，结合合成和制剂工艺路线分析，可鉴定结构。
有关物质1和2为劳拉西泮保留较弱的特征氧化降解杂质。测得它们的［M+NH4
Figure 9 MS/MS fragmentation pathways of [M+NH4
有关物质4、6、7和8为劳拉西泮的氧化降解杂质。测得［M+H
Figure 10 LC chromatogram （A） and EIC chromatogram （B） of related substances 4, 6, 7 and 8
有关物质9和10在碱性和光照、氧化破坏条件下均可产生。测得［M+H
Figure 11 MS/MS fragmentation pathways of [M+H
有关物质13为劳拉西泮的特征酸降解杂质。测得［M+H
Figure 12 MS/MS fragmentation pathways of [M+H
有关物质15和18主要在高温和氧化破坏条件下产生。测得它们［M+H
有关物质11、16和20主要在氧化和酸破坏条件下产生。测得［M+H
Figure 13 MS/MS fragmentation pathways of [M+H
有关物质19、21和22均为劳拉西泮的高温降解杂质。测得它们［M+H
Figure 14 MS/MS fragmentation pathways of [M+H
Figure 15 LC chromatogram (A) and EIC chromatogram (B) of related substances 21 and 22
本研究建立的劳拉西泮片有关物质挥发性流动相HPLC检查方法适用于劳拉西泮片有关物质的色谱-质谱联用鉴定。在建立的LC-MS联用鉴定条件下，劳拉西泮与各有关物质均得到有效的分离，共检测到22个含量大于0.1%的有关物质，经鉴定，其中5个与药典收载已知有关物质相对应，其余17个均为本研究首次鉴定的未知有关物质。
强制降解试验表明，在氧化降解条件下劳拉西泮易与辅料中的乳糖发生美拉德反应生成的降解杂质1和2。在酸降解条件下，劳拉西泮氮杂䓬环上亚胺基易水解开环并氧化为二苯酮类降解杂质，包括有关物质13和17。在酸、高温和氧化降解条件下，劳拉西泮氮杂䓬环既易发生酰胺基水解开环并重排形成苯并哌嗪环类降解杂质：3、11、14、16、18 ~ 22；又易形成N氧化降解杂质：4 ~ 8、12和15。在碱和光照降解条件下，劳拉西泮氮杂䓬环上酰胺基易水解开环形成二苯亚胺类降解杂质9和10。
总之，劳拉西泮片在极端条件下均不稳定，因此，应该注意关键制备工艺过程的控制，并建立相应的关键质量属性控制指
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