摘要
为探讨胰岛素及油酸对结肠癌血清代谢物的调节作用,建立结肠癌细胞HCT116皮下移植瘤模型。裸鼠随机分为4组,每组6只,分别为对照组(CON)、胰岛素组(INS,每日皮下注射胰岛素2.5 U/kg)、油酸组(OA,每日灌胃油酸2.0 g/kg)、胰岛素及油酸联合给药组(IO,每日皮下注射胰岛素2.5 U/kg、灌胃油酸2.0 g/kg)。采用气质联用(GC/MS)及液质联用(LC-IT-TOF/MS)技术对各组血清样本进行非目标代谢组学分析。数据经前处理如峰识别、去卷积和峰对齐后,导入SIMCA-P软件进行多元统计分析。结果表明,IO组裸鼠体重最轻但瘤体最重,且IO组与CON组相比,血清代谢轮廓发生显著变化,主要差异代谢物为尿素、阿拉伯糖、胆固醇、L-乙酰肉碱和鞘氨醇;OA及INS组与对照组之间无明显差异。本研究表明,胰岛素和油酸联合给药促进了结肠癌发展,扰动了代谢物轮廓,研究结果可为结肠癌生物标志物发现及早期诊断提供理论依据。
结肠癌是一种常见的恶性肿瘤,具有较高的疾病发生率和病死
N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA,含量大于99.9%)、盐酸甲氧胺(MOX,含量大于99.9%)及吡啶(美国Sigma-Aldrich公司);甲醇、乙腈及乙酸乙酯(色谱纯)(德国Merk公司)。精蛋白生物合成人胰岛素注射液(预混30R)[诺和诺德(中国)制药有限公司];油酸(分析纯,上海易恩化学技术有限公司);其他试剂均为市售分析纯。
GC/MS-QP2010 Ultra气质联用仪、UFLC-IT-TOF/MS液质联用仪(日本岛津公司); CentriVa
动物自购进后于SPF级环境饲养5~7 d以适应实验环境,期间自由饮食,维持环境温度为(24 ± 2) ℃以及12 h/12 h昼夜循环。
常规培养人结肠癌细胞HCT116,收集对数生长期细胞,并以无血清培养基重悬,调整细胞密度为每毫升5 × 1
所有实验动物随机分为4组,每组6只,分别为对照组(CON)、胰岛素单独给药组(INS)、油酸单独给药组(OA)、胰岛素及油酸联合给药组(IO)。对照组给予空白溶媒;INS组给予胰岛素;OA组给予油酸;IO组均同时给予胰岛素和油酸。另外,为防止胰岛素引起的低血糖,INS和IO组均给予10%葡萄糖水溶液替代饮水。胰岛素以每日2.5 U/kg的剂量皮下注射方式给药;油酸以每日2.0 g/kg的剂量灌胃给药。首先进行为期10 d的预给药处理以营造高胰岛素和高油酸内环境,模拟2型糖尿病病理环境。10 d预给药结束后暂停给药,于第11天皮下注射HCT116细胞,建立裸鼠移植瘤模型。随后进行为期6 d的细胞定植,待细胞定植成功且移植瘤生长到体积为100 m
LC-MS样品前处理:4 ℃解冻血清样品,涡旋后取20 μL,加入含5 μg/mL格列本脲(内标)的乙腈溶液100 μL沉淀蛋白,涡旋,4 ℃,14 000 r/min,离心10 min,吸取上清液,以相同的条件再次离心,取上清液于进样小瓶,待LC-MS分析。
GC-MS样品前处理:4 ℃解冻血清样品,涡旋后取10 μL,加入含10 μg/mL十七酸(内标)的甲醇溶液100 μL,涡旋5 min,4 ℃,14 000 r/min离心2次,每次10min,取上清液80 μL。在上清液中加入10 mg/mL MOX溶液25 μL,涡旋1 min,37 ℃振荡反应1.5 h,50 ℃真空干燥2 h,加入MSTFA-乙酸乙酯(1∶4)溶液120 μL,涡旋1 min,37 ℃振荡反应2 h,将反应产物转移至进样小瓶,待GC-MS分析。
质量控制样本(QC)制备:从每份待测样本中取相同体积血清,混匀,作为QC样本。QC样本前处理方式与其他待测样本一致。仪器分析时,每4~6个待测样本插入1个QC样本,监测仪器和分析方法的可靠性。
LC-MS分析:色谱柱为Phenomenex Kinetex C18(100 mm × 2.1 mm,2.6 μm);流动相A为0.1%甲酸水溶液,B为乙腈;流速为0.4 mL/min;梯度洗脱(0~20 min,95%~5% A;20~23 min,5% A;23~30 min,95% A);柱温:40 ℃;进样器温度:4 ℃;进样量:5 μL。离子源为电喷雾离子源(electron spray ionization,ESI);正、负离子模式同时采集数据,质量扫描范围:m/z 100~1 000;检测电压:1.8 kV;离子源接口电压:正极4.5 kV,负极-3.5 kV;加热模块(heat block)温度:200 ℃;曲线脱溶剂管(CDL)温度:200 ℃;雾化气(氮气)速率:1.5 L/min;干燥气(氮气)压力:170 kPa。
GC-MS分析:色谱柱为Reste
原始数据经Profiling Solution软件处理后导出,经扣空白、缺失值填补、面积归一化等数据前处理,导入SIMCA-P 14.1软件进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal projection to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)。PCA得分图用于观察QC样本的聚集程度。OPLS-DA模型用于两组间差异离子筛选,模型中VIP > 1的离子,需进一步满足Mann-Whitney U检验P < 0.05和|Fold Change| > 1.5(FC,给药组/空白组)。LC-MS差异离子经文献和HMDB数据库(The Human Metabolome Database,http://www.hmdb.ca)比对,并结合实验室代谢物库进行差异代谢物鉴定;GC-MS差异离子则通过NIST11.library及标准品比对鉴定。
结肠癌细胞HCT116皮下移植瘤实验表明,胰岛素和油酸同时给药可以促进裸鼠皮下移植瘤增殖。最后一次给药结束后处死裸鼠,剥离瘤体,并对其重量进行测定。结果表明IO组瘤体最重,与INS组及OA组存在显著性差异(

Figure 1 Tumor weight (A) and body weight (B) of nude mice following subcutaneous transplantation of colon carcinoma cell HCT116 ()
CON: Control; OA: Oleic acid (2.0 g/kg); INS: Insulin (2.5 U/kg); IO: Insulin (2.5 U/kg) plus oleic acid (2.0 g/kg) Mann-Whitney U test,
利用Profiling Solution软件对GC-MS、LC-MS原始图谱数据进行峰提取(

Figure 2 Typical total ion chromatogram (TIC) of nude mice serum samples analyzed by LC-MS (ES

Figure 3 3-Dimensional PCA score plots from (A) LC-MS and (C) GC-MS data; and peak area of internal standard in all samples from (B) LC-MS and (D) GC-MS data
对LC-MS和GC-MS数据进行OPLS-DA分析,筛选满足VIP>1、Mann-Whitney U检验P<0.05和|FC| >1.5的离子进行代谢物鉴定。结果显示,INS组与OA组代谢轮廓和CON组相比,均未发生显著改变,未筛选出符合条件的差异代谢物。IO组与OA(

Figure 4 OPLS-DA score plots from LC-MS data (A, C, E) and OPLS-DA score plots based on GC-MS data (B, D, F)
A: OA vs IO (
*Results from Mann-Whitney U test;

Figure 5 Histograms of relative content in nude mice of differential metabolites screened from different comparisons
A:INS vs IO group; B:OA vs IO group;C:CON vs IO group Mann-Whitney U test,
本研究发现,同时给予HCT116细胞皮下移植瘤裸鼠胰岛素和油酸,血清中胆固醇含量显著提高。胆固醇是哺乳动物细胞膜组成以及维持膜完整性和流动性的主要脂类成分之
此外,本研究发现另一种参与体内脂肪酸转运的物质L-乙酰肉碱,在IO组含量显著下调,提示体内L-乙酰肉碱水平可能与肿瘤恶化程度呈现负相关的趋势。有研究证实,饮食补充肉碱和乙酰肉碱可以减轻小鼠DSS结肠炎相关结肠癌的严重程
糖尿病、肥胖等疾病是肿瘤的风险因
本研究建立了结肠癌细胞HCT116皮下移植瘤模型,对胰岛素及油酸给药后的荷瘤鼠血液样本进行非目标代谢组学分析,发现胰岛素和油酸联合给药促进了结肠癌发展,扰动了血清代谢物轮廓,相关结果为进一步研究糖尿患者结肠癌发病机制奠定了基础,也可为结肠癌患者的临床诊断和治疗提供参考。
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