摘要
以A环1,2-亚甲二氧基为取代,合成了一系列在D环9,10,11位含不同取代基的共10个阿朴菲类生物碱,其结构均经 ESI-MS、13C NMR和1 H NMR确认。通过MTT实验探究此类化合物对B16F10黑色素瘤细胞的潜在抗肿瘤活性,并进一步分析其构效关系,同时采用斑马鱼体内急性毒性实验对活性化合物进行安全性评价。结果表明,部分化合物对肿瘤细胞具有较强的抑制活性,可以显著抑制B16F10黑色素瘤细胞的增殖,其中化合物Ⅳa的抗黑色素瘤活性最强且安全范围大,可作为抗B16F10黑色素瘤细胞增殖的先导化合物进一步研究。
阿朴菲类生物碱是天然生物碱的一个重要类型,在自然界中广泛分布并具有重要生物学活性[1]。天然阿朴菲类生物碱具有多种生物活性,包括抗氧化、抗炎、抗血小板凝聚、抗惊厥、抗痉挛、抗肿瘤等[2-8]。已有研究报道A环1,2-亚甲二氧基取代后有助于提高阿朴菲类生物碱的抗肿瘤活性[6,9]。目前阿朴菲类生物碱对肺癌细胞株A549、子宫颈癌细胞株HeLa、乳腺癌细胞株MCF-7、肝癌细胞系HepG-2、人类结肠癌细胞株HCT-116等几种较常见癌细胞的抑制作用报道较多[6,10],对黑色素瘤相关的抗肿瘤活性尚未见系统报道。
为了研究阿朴菲类生物碱对黑色素瘤的调控作用,本研究以A环1,2-亚甲二氧基为取代,合成了一系列在D环9,10,11位含不同取代基的阿朴菲类生物碱,以天然产物中较常见的羟基和甲氧基取代为主,采用B16F10黑色素瘤细胞对10个合成阿朴菲生物碱进行抗肿瘤活性评价,并进一步分析其构效关系,对活性较好的化合物采用斑马鱼进行体内安全性评价,以期为阿朴菲类生物碱治疗色素相关疾病提供参考。
以邻溴苯甲醛衍生物(1)为原料,通过Wittig反应得到苯乙烯甲基醚(2),2与酰化苯乙胺(4)通过Pictet-Spengler反应得到苄基四氢异喹啉(5),而后通过Heck反应关环得关环产物(6),最后经钯碳氢解脱保护得到目标化合物(Ⅳ)。
Scheme 1 Synthesis of aporphine alkaloids IVa-IVk
Reagents and conditions: (i) iA: BnBr, K2CO3, DMF or CH3CN, 60 °C, reflux; iB: MeOCH2PPh3Cl, NaOtBu, CH2Cl2, 0 °C; (ii) CbzCl, K2CO3, CH2Cl2, 35 °C, reflux; (iii) TFA, CH3CN, N2, r.t.; (iv) Xphos, Pd(OAc)2, Cs2CO3, DMA, 130 °C, reflux; (v) Pd/C, H2, THF-MeOH (1∶2-1∶4), r.t.
AV-300核磁共振仪(瑞士Bruker公司,TMS为内标)、Waters Q-TOF Micro质谱仪(美国沃特世公司)、智能光照培养箱(宁波赛福实验仪器有限公司)、SZX-16斑马鱼体视镜(日本奥林巴斯公司)、多功能酶标仪(美国伯腾Synergy公司)、所有试剂未经特别说明均为市售化学纯或分析纯产品。石油醚的沸程为60 ~ 90 ℃。除特别说明外,未经处理直接使用,部分溶剂经实验室严格无水处理后使用。
步骤i:Wittig反应。iA:在250 mL单颈瓶中,加入6-溴异香草醛(45 mmol,10.4 g)、K2CO3(90 mmol,12.4 g),加入乙腈100 mL溶解,60 ℃加热反应,溶液由无色变为淡黄色悬浊物,而后少量多次加入溴化苄(50 mmol,6 mL),有大量白色物质析出,60℃加热回流6 h;浓缩反应液至5 ~ 10 mL,水洗,抽滤,得白色粉末13.8 g,产率95.8%。iB:在250 mL二颈瓶中,加入上述白色粉末(40 mmol,13.8 g),甲氧基甲基三苯基氯化膦(60 mmol,20.52 g)、NaOtBu(60 mmol,5.76 g),氮气保护,冰浴,用注射器快速加入无水CH2Cl2 50 mL,约3 ~ 5 min溶液由无色变为淡黄色再至红棕色,TLC检测反应,反应结束后立即用水淬灭,经硅胶柱色谱(100 ~ 200目硅胶,洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯(30∶1)纯化得白色粉末(化合物2c)14.4 g,产率96.8%。
步骤ii:氨基保护。将3,4-亚甲二氧基苯乙胺(50 mmol,8.25 g)溶于CH2Cl2 50 mL,依次加入K2CO3(60 mmol,8.28 g),氯甲酸苄酯(50 mmol,8.55 g),回流,TLC监测,约6 h反应完毕,水洗,CH2Cl2萃取,浓缩后用少量EtOAc溶解,再缓慢多次加入石油醚,析出固体,抽滤,得白色粉末(化合物4c)13.65 g,产率91.3%。
步骤iii:Pictet-Spengler反应。在100 mL茄型瓶中加入CH3CN 25 mL,依次加入三氟乙酸(4 mmol,300 μL)、化合物4c(3.3 mmol,0.98 g)、化合物2c(3.0 mmol,1.04 g),氮气保护,常温搅拌2d,可见大量白色粉末析出,抽滤,得到产物(化合物5c)1.58 g,产率85.6%。
步骤iv:Heck反应。在50 mL二颈瓶中依次加入化合物5c(2 mmol,1.23 g)、Pd(OAc)2 (0.2 mmol, 45 mg)、Xphos(2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯,0.4 mmol,190 mg),Cs2CO3(3 mmol,0.97 g),氮气保护,用注射器加入二甲基乙酰胺(DMA) 15 mL,回流反应2 h,TLC监测,反应结束后,冷却至室温,加入CH2Cl2 45 mL,混匀,加入水90 mL,CH2Cl2萃取,浓缩,经硅胶柱色谱纯化[100 ~ 200目硅胶,洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯(10∶1)]得白色粉末(化合物6c)1.04 g,产率97.5%。
步骤v:脱保护。在50 mL二颈瓶依次加入化合物6c(1.0 mmol,535 mg)、10% Pd/C 55 mg,氢气置换,用注射器加入THF 5 mL溶解样品,而后加入MeOH 10 mL,常温搅拌2 h,TLC监测,反应结束后,硅藻土过滤,滤液浓缩,经硅胶柱色谱[100 ~ 200目硅胶,洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(15∶1)]纯化得终产物(Ⅳc)237.3 mg,产率76.3%。总收率58.1%。ESI-MS:312.2[M+H]+,310.1[M-H]-,分子式为C18H17NO4。1H NMR (300 MHz,DMSO-d6) δ:7.57(1H,s,H-11),6.72(1H,s,H-8),6.59(1H,s,H-3),6.11(each 1H,d,J = 1.0 Hz,-OCH2O-),5.97(each 1H,d,J = 1.0 Hz,-OCH2O-),3.77(3H,s,10-OCH3),3.76(1H,m,H-6a),3.22(1H,m,H-5a),2.90 ~ 2.80(2H,m,H-5b,7a),2.74(1H,dd,J = 14.4,5.0 Hz,H-7b),2.66 ~ 2.52(2H,m,H-4a,4b)。13C NMR(75 MHz,DMSO-d6) δ:146.4,146.2,146.2,140.9,128.4,126.6,126.6,121.5,115.9,115.4,111.6,106.6,100.4,56.0,53.1,42.3,35.1,28.3。
参照化合物Ⅳc的制法,以6-溴藜芦醛替为原料,去除iA合成步骤,得红棕色固体280.2 mg,产率53.0%。ESI-MS:326.2[M+H]+,分子式为C19H19NO4。1H NMR(300 MHz,Chloroform-d) δ:7.68(1H,s,H-11),6.76(1H,s,H-8),6.53(1H,s,H-3),6.08(each 1H,d,J = 1.4 Hz,-OCH2O-),5.93(each 1H,d,J = 1.4 Hz,-OCH2O-),3.97(1H,dd,J = 13.7,5.5 Hz,H-6a),3.92(3H,s,10-OCH3),3.91(3H,s,9-OCH3),3.39(1H,dt,J = 10.0,4.9 Hz,H-5a),3.11 ~ 2.90(2H,m,H-5b,7a),2.89 ~ 2.74(2H,m,H-7b,4a),2.67(1H,t,J = 14.0 Hz,H-4b)。13C NMR(75 MHz,DMSO-d6) δ:148.2,147.2,145.9,141.0,128.7,127.9,127.1,123.0,115.5,111.9,111.0,107.0,100.3,55.8,55.5,53.3,42.8,35.9,29.0。
参照化合物Ⅳc的制法,以6-溴香兰素为原料,得白色粉末241.6 mg,产率43.9%。ESI-MS:312.2[M+H]+,310.1[M-H]-,分子式为C18H17NO4。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6) δ:8.87(1H,s,10-OH),7.50(1H,s,H-11),6.86(1H,s,H-8),6.58(1H,s,H-3),6.09(each 1H,s,-OCH2O-),5.97(each 1H,s,-OCH2O-),3.80(3H,s,9-OCH3),3.74(1H,dd,J = 14.2,5.0 Hz,H-6a),3.19(1H,m,H-5a),2.91 ~ 2.71(3H,m,H-5b,7a,7b),2.63 ~ 2.53(2H,m,H-4a,4b)。 13C NMR(75 MHz,DMSO-d6) δ:147.0,146.0,144.8,141.0,127.6,126.8,126.6,123.0,115.7,114.1,112.0,106.8,100.2,55.6,53.4,42.6,35.7,28.8。
参照化合物Ⅳc的制法,以6-溴-3,4-亚甲基二氧苯甲醛为原料,去除iA合成步骤,得白色粉末233.3 mg,产率41.4%。ESI-MS:310.1[M+H]+,分子式为C18H15NO4。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6) δ:7.42(1H,s,H-11),6.84(1H,s,H-8),6.54(1H,s,H-3),6.02(each 1H,s,9,10-OCH2O-),5.95(each 1H,s,9,10-OCH2O-),5.93(each 1H,s,1,2-OCH2O-),5.88(each 1H,s,1,2-OCH2O-),3.67(1H,dd,J = 14.0,4.9 Hz,H-6a),3.12(1H,m,H-5a),2.79 ~ 2.66(3H,m,H-5b,H-7a,H-7b),2.46 ~ 2.40(2H,m,H-4a,4b)。 13C NMR(75 MHz,DMSO-d6) δ:147.1,146.7,146.4,141.8,127.8,125.3,123.5,122.8,115.4,108.8,107.1,106.6,101.2,101.0,52.1,41.1,33.4,26.1。
参照化合物Ⅳc的制法,以2-溴-4-甲氧基苯甲醛为原料,去除iA合成步骤,得红棕色固体215.9 mg,产率51.1%。ESI-MS:296.2[M+H]+,分子式为C18H17NO3。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6) δ:7.57(1H,d,J = 2.6 Hz,H-11),7.23(1H,d,J = 8.2 Hz,H-8),6.85(1H,dd,J = 8.2,2.6 Hz,H-9),6.69(1H,s,H-3),6.15(each 1H,d,J = 1.0 Hz,-OCH2O-),5.99(each 1H,d,J = 1.0 Hz,-OCH2O-),3.83(1H,dd,J = 13.8,4.9 Hz,H-6a),3.77(3H,s,10-OCH3),3.25(1H,m,H-5a),2.95 ~ 2.79(3H,m,H-5b,7a,7b),2.67 ~ 2.52(2H,m,H-4a,4b)。13C NMR(75 MHz,DMSO-d6) δ:158.1,146.3,142.0,131.3,128.8,127.2,126.9,126.6,115.2,112.7,112.5,107.9,100.7,55.1,53.1,42.2,34.7,28.1。
参照化合物Ⅳc的制法,以2-溴-5-甲氧基苯甲醛6-溴藜芦醛为原料,去除iA合成步骤,得红棕色固体225.0 mg,产率37.7%。ESI-MS:296.2[M+H]+,分子式为C18H17NO3。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6) δ:7.91(1H,dd,J = 9.4 Hz,H-11),6.89(1H,d,J = 9.4,2.3 Hz,H-10),6.87(1H,d,J = 2.3 Hz,H-8),6.60(1H,s,H-3),6.10(each 1H,d,J = 1.0 Hz,-OCH2O-),5.96(each 1H,d,J = 1.0 Hz,-OCH2O-),3.79(3H,s,9-OCH3),3.74(1H,dd,J = 14.0,4.8 Hz,H-6a),3.19(1H,d,J = 8.0 Hz,H-5a),2.93 ~ 2.74(3H,m,H-5b,7a,7b),2.66 ~ 2.53(2H,m,H-4a,4b)。13C NMR(75 MHz,DMSO-d6) δ:158.5,146.0,141.1,137.2,127.8,127.6,126.9,123.3,115.3,113.5,112.2,106.9,100.3,55.0,53.0,42.6,36.5,28.8。
参照化合物Ⅳc的制法,以2-溴-5-羟基苯甲醛为原料,得白色粉末233.5 mg,产率51.1%。ESI-MS:282.2[M+H]+,280.1[M-H]-,分子式为C17H15NO3。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6) δ:9.54(1H,s,9-OH),7.80(1H,d,J = 8.2 Hz,H-11),6.71(1H,dd,J =8.2,2.6 Hz,H-10),6.68(1H,d,J = 2.6 Hz,H-8),6.55(1H,s,H-3),6.07(each 1H,d,J = 1.0 Hz,-OCH2O-),5.93(each 1H,d,J = 1.0 Hz,-OCH2O-),3.68(1H,dd,J = 13.9,4.9 Hz,H-6a),3.16(1H,m,H-5a),2.84 ~ 2.64(3H,m,H-5b,7a,7b),2.61 ~ 2.51(2H,m,H-4a,4b)。13C NMR(75 MHz,DMSO-d6) δ:156.8,145.9,140.8,137.3,127.9,127.9,127.0,121.8,115.7,114.9,113.5,106.5,100.2,53.2,42.8,36.7,29.0。
参照化合物Ⅳc的制法,以2-溴-3-羟基苯甲醛为原料,得黄绿色粉末231.0 mg,产率52.3%。ESI-MS:282.2[M+H]+,分子式为C17H15NO3。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6) δ:9.54(s,1H,11-OH),7.15(1H,t,J = 7.7 Hz,H-9),6.86(1H,d,J = 8.1 Hz,H-10),6.81(1H,d,J = 7.3 Hz,H-8),6.79(1H,s,H-3),6.10(each 1H,d,J = 1.1 Hz,-OCH2O-),5.96(each 1H,d,J = 1.0 Hz,-OCH2O-),4.14(1H, dd,J = 13.6,3.9 Hz,H-6a),3.55(1H,d,J = 7.5 Hz,H-5a),3.23 ~ 3.10(2H,m,H-5b,7a),3.03(1H,dd,J = 14.0,4.0 Hz,H-7b),2.92 ~ 2.71(2H,m,H-4a,4b)。13C NMR(75 MHz,DMSO-d6) δ:154.40,147.50,142.75,135.25,128.95,123.59,122.94,118.30,116.89,115.78,113.34,106.48,100.39,51.91,42.3,33.88,24.79。
参照化合物Ⅳc的制法,以2-溴-4-羟基苯甲醛为原料,得黄绿色粉末242.2 mg,产率53.7%。ESI-MS:282.2[M+H]+,280.1[M-H]-,分子式为C17H15NO3。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6) δ:9.31(1H,s,10-OH),7.48(1H,d,J = 2.5 Hz,H-11),7.08(1H,d,J = 8.1 Hz,H-8),6.66(1H,dd,J = 8.1,2.5 Hz,H-9),6.65(1H,s,H-3),6.13(each 1H,s,-OCH2O-),5.99(each 1H,s,-OCH2O-),3.78(1H,dd,J = 13.9,4.8 Hz,H-6a),3.21(1H,m,H-5a),2.98 ~ 2.71(3H,m,H-5b,7a,7b),2.67 ~ 2.51(2H,m,H-4a,4b)。13C NMR(75 MHz,DMSO-d6) δ:156.0,146.2,141.9,131.2,128.7,127.5,126.6,125.2,115.5,114.5,113.5,107.7,100.5,53.3,42.3,34.9,28.3。
参照化合物Ⅳc的制法,以邻溴苯甲醛为原料,去除iA合成步骤,得红棕色固体236.1 mg,产率58.6%。ESI-MS:266.2[M+H]+,分子式为C17H15NO2。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6) δ:7.98(1H,m,H-11),7.38 ~ 7.10(3H,m,H-8,9,10),6.65(1H,s,H-3),6.12(each 1H,d,J = 1.0 Hz,-OCH2O-),5.97(each 1H,d,J = 1.0 Hz,-OCH2O-),3.72(1H,dd,J = 13.9,4.7 Hz,H-6a),3.16(1H,m,H-5a),2.89 ~ 2.75(3H,m,H-5b,7a,7b),2.67 ~ 2.53(2H,m,H-4a,4b)。13C NMR(75 MHz,DMSO-d6) δ:146.1,141.8,135.5,130.7,128.5,128.0,127.4,127.1,126.7,126.4,115.2,107.8,100.4,53.0,42.7,36.3,28.9。
采用MTT法[11]测试目标化合物Ⅳa ~Ⅳk对B16F10黑色素瘤的抗增殖活性。用DMSO配成1.0 × 10-2 mol/L的母液,用DMEM培养液稀释至所需浓度(0,2.5,5,10,20,40 µmol/L)即为供试液。取对数生长期细胞接种到96孔板中,接种浓度为每孔3 000个细胞,接种体积为每孔100 μL,用含有体积分数为10%的胎牛血清的培液培养 24 h,然后暴露于不同浓度的药物中。孵育48 h后,每孔加入MTT溶液(5 mg/mL,用灭菌磷酸盐缓冲液溶解)10 µL,孵育4 h,吸出上清液,每孔加入DMSO 150 µL,平板摇床震摇10 min以溶解甲臜晶体。在570 nm下用酶标仪测量每孔吸收度(A)。化合物的抑制率计算公式为:抑制率(%)=(1 - Atreated/Acontrol)× 100,以IC50评价化合物的活性,结果如表1所示。
Table 1 IC50 of taget compounds against B16F10 ()
Compd. | IC50a/(µmol/L) |
IVa |
4.89 ± 0.18 |
IVb |
10.22 ± 0.28 |
IVc |
18.51 ± 0.48 |
IVd |
5.92 ± 0.21 |
IVe |
5.41 ± 0.12 |
IVf |
6.74 ± 0.34 |
IVg |
21.09 ± 1.30 |
IVh |
> 40 |
IVi |
10.86 ± 0.26 |
IVk |
16.56 ± 0.52 |
aMTT assay,cells were incubated with corresponding compounds for 48 h
斑马鱼源于国家斑马鱼资源中心,按照《The Zebrafish Book》中方法进行斑马鱼饲养[12]循环水系统水温为28.5 ℃,每天固定光照时间为14 h,早晚饲喂丰年虾一次。收集胚胎前一天晚上将斑马鱼雌鱼、雄鱼等比例放置于产卵缸中,以隔板将雌雄分开,按照正常光照时间,22:00关灯,第2天8:00光照刺激并抽离隔板使雌雄交配。30 min后收集胚胎并利用Eggwater清洗,饲养于28.5 ℃的光照培养箱中。收集斑马鱼胚胎并在其发育至受精后6 h(6 hpf)时将胚胎浸泡至已配好的相应浓度梯度的药物溶液中。在斑马鱼发育至24 hpf,48 hpf,72 hpf,96 hpf,120 hpf时任选3条斑马鱼拍照,观察其是否有心包水肿、畸形、体长、黑色素异常等毒性[13]。结果如图1所示。
Figure 1 Morphological effects of different concentrations of compounds on zebrafish at different developmental stages
A: Compound IVa; B: Compound IVb; C: Compound IVc; D: Compound IVd; E: Compound IVe; F: Compound IVf; G: Compound IVg; H: Compound IVh; I: Compound IVi; K: Compound IVk
从表1可见,此类目标化合物具有较好的抗黑色素瘤活性,其中化合物Ⅳa的活性最强,IC50为(4.89 ± 0.18) µmol/L。初步构效关系分析表明,1,2-亚甲二氧基取代的阿朴菲生物碱,当R2,R3(即9,10位)取代为烷氧基或亚甲二氧基时可显著增加抗肿瘤活性,而R2或R1(即9,11位)羟基取代则不利于活性增强,其中以9,10位烷氧基双取代活性最佳(化合物Ⅳa),IC50为(4.89 ± 0.18) µmol/L。
为进一步评价此类化合物的安全性,进行了斑马鱼体内急性毒性实验。由图1可知,不同化合物的体内毒性相差较大,化合物Ⅳa,Ⅳb,Ⅳc,Ⅳd,Ⅳe,Ⅳf,Ⅳg,Ⅳi,Ⅳk作用于斑马鱼后分别于50,10,7.5,15,5,30,50,30,5 µmol/L出现明显的毒性,化合物Ⅳa,Ⅳb,Ⅳc,Ⅳi,Ⅳe主要表现为发育畸形,如体长降低,脊背弯曲。化合物Ⅳd,Ⅳf,Ⅳg主要毒性为心脏毒性,即出现心包水肿,而化合物Ⅳk毒性主要表现为色素异常缺失。结合上述化合物IC50可知,化合物Ⅳa的抗肿瘤活性最强且安全范围大,可作为抗B16F10黑色素瘤细胞增殖的先导化合物进一步研究。
本研究以A环1,2-亚甲二氧基为取代,合成了一系列在D环9,10,11位含不同取代基的共10个阿朴菲类生物碱,通过MTT实验探究此类化合物对B16F10黑色素瘤细胞潜在的抗肿瘤活性,并进一步分析其构效关系。同时采用斑马鱼体内急性毒性实验对活性化合物进行安全性评价。构效关系显示当A环1,2位取代亚甲二氧基时,9,10位双取代或单取代烷氧基基团有助于抗肿瘤活性的提高。结合细胞毒性和体内安全性评价,化合物Ⅳa的抗肿瘤活性最强且安全范围大。本研究的初步研究结果提示,阿朴菲类生物碱可能有望用于色素相关疾病的治疗,值得进一步研究。
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