摘要
研究四妙丸提取物的60%乙醇洗脱部位(ESMW)对肝脏脂质蓄积的改善作用及其机制。采用甘油三酯(TG)试剂盒、BODIPY荧光染色、QPCR、Western blot、油红O染色、AMPKα敲减等方法检测四妙丸提取物ESMW对游离脂肪酸诱导的肝细胞脂质蓄积的改善作用;并在高脂饲喂小鼠中,通过检测ESMW对高脂饮食小鼠的口服糖耐量、血脂、肝脏脂质水平、肝组织脂代谢相关mRNA及蛋白表达等生化指标,验证ESMW对肝脏脂质蓄积的改善作用及其机制。结果表明,ESMW通过调节AMPK信号通路抑制游离脂肪酸诱导的肝原代细胞脂质堆积;显著改善了高脂饮食小鼠肝脏的脂质堆积,且该药效的发挥与AMPK信号通路有关。
近年来,随着人们生活水平的提高,肥
四妙丸由黄柏、苍术、牛膝、薏苡仁组成,具有健脾助运,清热燥湿的功效,临床用于关节
腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)作为细胞内重要的能量感受器参与脂质代谢的调节,有研究表明小檗碱既可以通过调节AMP/ATP比值激活AMP
本课题组前期研究发现,四妙丸提取物的ESMW是四妙丸调节脂代谢的活性部位,本研究以游离脂肪酸诱导肝细胞脂质堆积细胞模型,探索ESMW改善肝脏脂质蓄积的能力及作用机制,并在高脂饲喂的小鼠中验证ESMW对肝脏脂代谢的调节作用。
ESMW(本课题组制备,提取率0.92%);脱脂牛血清白蛋白(北京索莱宝科技有限公司);棕榈酸钠、油酸钠、油红O、BODIPY荧光染料、Hoechst荧光染料(美国Sigma公司);AMPK激动剂A-769662(美国MCE公司);二甲双胍[阿拉丁试剂(上海)有限公司];高脂饲料D12492、对照饲料D12450B(美国Research Diets公司);Trizol总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、定量PCR检测试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司);RAPI裂解液;BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司);TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA测试试剂盒(南京建成生物工程研究所);INS、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司);AMPK、p-AMPK、LKB1、p-LKB1、elF4EBP1、p-4EBP1、FASN抗体(英国Abcam公司);ACC、p-ACC抗体(美国CST公司);SREBP-1抗体、Reagent、Medium(美国Santa Cruz Biotechnology公司);β-actin、羊抗小鼠、羊抗兔抗体(美国Bioworld Technology公司);AMPKα、Control siRNA(上海吉满生物科技有限公司);实验中所用引物均合成于上海生工生物工程有限公司,种属均为小鼠,其序列见
血糖仪、血糖试纸(三诺生物传感股份有限公司);酶标仪、自动纯水机、Real-Time qPCR(美国Thermo Fisher Scientific公司);低温高速离心机、梯度PCR仪(德国Eppendorf公司);Olympus IX53倒置显微镜(日本Olympus公司);Nano Zoomer2.0RS切片扫描仪(日本Hamamatsu公司);Tanon 5200化学发光成像仪(上海天能科技有限公司);Nano-100微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)。
苍术和薏苡仁药材饮片按照质量比1∶2混合,10倍量乙醇加热回流提取2 h,趁热过滤,药渣与牛膝和黄柏药材饮片(1∶2)用30倍水加热回流提取2 h后,pH调至8,12 000 r/min离心10 min得上清液,用0.22 μm微滤系统,将制得的上清液过300 kD超滤膜,超滤至截留体积为原溶液的60%;将透过液过10 kD超滤膜,超滤至截留体积为原溶液的50%。将10 kD透过部分过AB-8型大孔树脂,经过吸附和乙醇梯度洗脱,收集60%乙醇洗脱液,浓缩得ESMW(主要复方中的小分子类化合物,包括:黄柏中9个生物碱类成分phellodendrine,magnofliorine,tembetarine,lotusine,menisperine,columbamine,jatrorrhizine,berberrubine and berberine,苍术中的atractylenolide III和atractylone,薏苡仁和黄柏中的caffeoyl-CH2-O-quinic acid,牛膝中的dibutyl phthalate)。
精密称取棕榈酸钠粉末0.027 84 g、0.030 44 g油酸钠粉末,加入灭菌双蒸水0.5 mL于75 ℃金属浴上加热至溶液澄清,制得200 mmol/L的母液。将母液趁热转移至10%BSA溶液4.5 mL中得20 mmol/L PA、OA,吹匀,分装,-20 ℃冰箱保存备用。
精密吸取20 mg/mL ESMW母液50 μL,加入到灭菌PBS缓冲液2 mL中,吹匀,即得500 μg/mL细胞用ESMW母液,分装并保存于-20 ℃冰箱,按照逐级稀释的配制方法,将500 μg/mL细胞用ESMW母液稀释为低中高3个浓度:ESMW-L(0.5 μg/mL),ESMW-M(1 μg/mL),ESMW-H(2 μg/mL)。
油红O母液:称取油红O粉末0.2 g加入异丙醇40 mL,避光超声使其溶解,置4℃冰箱避光保存备用。
精密称取ESMW,用3%泊洛沙姆溶液分别配制成7.124 mg/mL混悬液;二甲双胍用3%泊洛沙姆溶液分别配制成20 mg/mL溶液;4 ℃保存,用前混匀。
两步灌流法提取小鼠肝原代细胞,DMEM高糖培养基孵育24 h后,细胞密度为70% ~ 80%时,加入棕榈酸(palmitate,PA,150 μmol/L)+油酸(oleinic acid,OA,150 μmol/L)(1∶1)或PA+OA+不同剂量的ESMW或A-769662(2 μmol/L)继续共孵育24 h,收集细胞用于后续实验。
当HepG2细胞密度达40% ~ 50%时,将细胞培养基换成无血清无双抗的DMEM高糖培养基0.8 mL,细胞培养箱孵育40 min,配制转染液。A液:AMPKα siRNA3 μL加培养基97 μL混匀,避光放置备用。(对照组加Control siRNA);B液:转染试剂3 μL加培养基97 μL混匀,避光放置备用。将A加入B中,吹匀,避光静置20 min;将混合液0.2 mL均匀加入一个孔中,轻轻摇匀。12 h后,向转染培养基中加入含血清含双抗的DMEM高糖培养基1 mL,继续培养12 h,再进行验证或者给药。给药:加入棕榈酸(palmitate,PA,150 μmol/L)+油酸(oleinic acid,OA,150 μmol/L)(1∶1),或PA+OA+ESMW(1 μg/mL)共孵育24 h。收集细胞进行Western blot实验或油红O染色实验。
将40只小鼠适应性饲养1周后,按体重随机分为:对照组(Control)、模型组(Model)、ESMW给药组(ESMW,71.24 mg/kg,相当于7 743.16 mg/kg四妙丸生药量)、阳性药组(二甲双胍,200 mg/kg),每组10只。对照组小鼠给予对照饲料饲养,其余小鼠均给予高脂饲料饲养。实验开始时,每天灌胃给药,给药体积为0.01 mL/g小鼠,对照组、模型组给予等体积3%泊洛沙姆溶液。
原代细胞接于共聚焦小皿中,舒展24 h至密度为60% ~ 80%时,造模并给药;给药24 h后,吸去上清液,用PBS溶液润洗后,每孔加入BODIPY荧光染料溶液(BODIPY母液稀释1 000倍)100 μL孵育15 min。弃去BODIPY,每孔加入Hoechst荧光染料溶液(Hoechst母液稀释100倍)100 μL孵育10 min。弃去Hoechst,用灭菌PBS洗3次后,每孔加入PBS 100 μL,避光在激光共聚焦显微镜63 × 油镜下观察并拍照。
细胞给药24 h后,弃上清液,加入37 ℃预热的PBS溶液1 mL润洗,吸尽弃去PBS溶液,每孔加4%多聚甲醛溶液1 mL,室温固定30 min。吸尽弃去多聚甲醛溶液,每孔加入60%异丙醇溶液(9 mL异丙醇∶6 mL PBS)1 mL,室温孵育1 min。吸尽弃去异丙醇溶液,每孔加入油红O工作液(15 mL油红O母液∶10 mL PBS)1 mL,室温避光染色30 min。吸尽弃去油红O工作液,用PBS溶液洗4次,每次5 min。每孔加PBS溶液1 mL,在倒置显微镜下拍照。
实验第9周,动物禁食不禁水16 h,酒精棉片擦拭尾尖,消毒剪刀剪尾尖,取1滴尾尖血于试纸上测量并记录血糖值,为0 min血糖值。灌胃0.2 g/mL葡萄糖溶液(2 g/kg,0.1 mL/10 g动物),分别测定并记录30、60、90、120 min时间点处血糖值,计算曲线下面积。
实验第12周,动物禁食不禁水12 h,取血离心得血清,脱颈处死动物,解剖分离肝脏,称重并拍照。肝脏分3份:(1)用胶水包埋做冰冻切片,用于肝脏油红O染色切片的制作;(2)4%多聚甲醛固定,用于肝脏HE染色切片的制作;(3)剩余肝脏样品与血清放置于-80 ℃冰箱冻存。
精密称取肝组织30 mg,加入RAPI裂解液500 μL,匀浆10 min后冰上裂解30 min(细胞样品加入RAPI裂解液30 ~ 50 μL后,吹匀冰上裂解30 min)。4 ℃,12 000 r/min离心20 min,避开最上层脂质,取上清液。BCA定量后,调至统一浓度,加入5 × 上样缓冲盐,100 ℃金属浴加热变性5 min,将样品插入冰盒降温后,-20 ℃保存备用。每孔加入蛋白样品45 μg,经SDS-PAGE电泳、半干转膜法转膜后,将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2 h,对应一抗在4 ℃冰箱中孵育过夜,TBST洗30 min,对应二抗室温孵育1 h,TBST洗30 min,ECL显影。每个指标重复3次,Image J计算灰度。
TG试剂盒检测结果显示(

Figure 1 Effects of 60% ethanol extract of Si Miao Wan (ESMW) on lipid accumulation in primary mouse hepatocytes induced by free fatty acids ()
A: TG levels determined by TG kits ();B: BODIPY fluorescence stainin
QPCR的结果显示(

Figure 2 Effects of ESMW on Srebp-1、Acc and Fasn mRNA and protein expression ()
A-C: Effects of ESMW on the mRNA expression of Srebp-1, Acc and Fasn in cells; D-G: Effects of ESMW on the proteins expression of SREBP-1, ACC and FASN in cell

Figure 3 Effects of ESMW on LKB1-AMPK-mTOR signaling pathway ()
A: Primary mouse hepatocytes were co-incubated with ESMW and the effects of ESMW on AMPK activation were detected by Wester blot; B-D: Primary mouse hepatocytes were co-incubated with palmitate (PA, 150 μmol/L) + Oleinic acid (OA, 150 μmol/L) (1∶1) or PA + OA + ESMW. The effects of ESMW on the phosphorylation of AMPK, LKB1 and 4EBP1 were detected by Western blo
实验结果表明,游离脂肪酸作用下,LKB1的磷酸化水平受到抑制(
AMPKα敲减后,HepG2细胞中AMPK蛋白表达显著降低,表明敲降成功(

Figure 4 ESMW inhibited lipid accumulation in HepG2 cells by AMPK activation ()
A: AMPK expression; B: p-SREBP1 expression; C-D: Levels of TG in cells were detected by oil red O and TG kit

Figure 5 Effects of ESMW on body weight (A) and oral glucose tolerance (B, C) in mice fed with high fat diet ()Control: Normalmice; Model: High fat diet-fed mice; ESMW: High fat diet-fed mice treated with ESMW; MET: High fat diet-fed mice treated with metformin
##P < 0.01 vs control group;
血浆生化指标结果如
##P < 0.01 vs control group;
肝脏是脂质代谢的重要器官,前面的实验表明ESMW能抑制游离脂肪酸诱导的肝脏脂质蓄积。在高脂饲喂动物中,模型组小鼠的肝脏重量显著增加(

Figure 6 Effects of ESMW on lipid accumulation in liver of mice fed high fat diet ()
A: Liver tissues; B: Liver tissues after oil red O staining (400 × ); C: Liver tissues after HE staining (400 × ); D: Weight of liver; E: TG of liver tissues
脂质代谢包括脂质摄取、脂质合成、脂质转运、脂质的β氧化等多个环节。前面实验中本课题组发现ESMW能抑制游离脂肪酸诱导的脂质合成相关基因的表达,因此,在高脂饲喂小鼠体内,重点考察了ESMW对脂质合成相关基因(Srebp-1、Acc、Fasn mRNA)及脂质β氧化相关基因(Pparα、Pgc-1α、Cpt-1α、Fabp-2 mRNA)的影响。QPCR结果显示,模型组小鼠中脂质合成相关基因(Srebp-1、Acc、Fasn mRNA)的水平显著上调(

Figure 7 Effects of ESMW fraction on mRNA expression of lipid metabolism-related genes in liver of mice fed high fat diet ()
A:Srebp-1;B:Acc;C:Fasn;D:Ppar α;E:Pgc-1α;F:Cpt-1α;G:Fabp-
Western blot结果(

Figure 8 Effects of ESMW fraction on proteins expression of lipid metabolism-related genes and LKB1-AMPK-mTOR signaling pathway in liver of mice fed high fat diet ()
A:SREBP-1;B:ACC;C: LKB1;D:AMPK;E:4EBP1
与体外实验结果一致,高脂抑制了小鼠肝脏中LKB1的磷酸化(
本研究首先以游离脂肪酸诱导小鼠肝原代脂质蓄积细胞模型,TG试剂盒及BODIPY荧光染色结果表明ESMW可有效降低细胞内的脂质堆积。QPCR及Western blot结果表明,ESMW通过调节SREBP-1、ACC、FASN抑制游离脂肪酸诱导的脂质合成。在正常生理状态的肝原代细胞中,ESMW剂量依赖性激活AMPK;且在脂质蓄积细胞模型中检测到ESMW磷酸化LKB1和AMPK,抑制mTOR信号。
为了确认AMPK信号通路在ESMW调节脂代谢方面的作用,以AMPKα siRNA敲减HepG2细胞的AMPKα,TG试剂盒、油红O染色实验结果表明AMPKα敲减后,ESMW改善脂质蓄积的作用减弱;Western blot实验结果说明AMPKα敲减后,ESMW对p-SREBP-1蛋白的抑制作用减弱,进一步验证了ESMW至少部分是通过AMPK信号发挥脂代谢调节作用。
在高脂饮食诱导的糖脂代谢紊乱模型中,口服葡萄糖耐量和丙酮酸耐量实验结果显示,ESMW可以显著改善高脂饮食动物的葡萄糖耐量和糖异生功能。血清生化指标结果显示,糖脂代谢紊乱模型动物血清TG、TC、NEFA含量显著增加,而ESMW给药后可显著改善这些生化指标的异常变化。另外,血清中的炎症因子TNF-α在ESMW给药后显著降低,提示该部位还具有抗炎作用。
肝组织油红O染色、HE染色及TG试剂盒结果证实了ESMW能显著降低肝脏的脂质蓄积。同时,在ESMW给药后,小鼠肝脏中与脂质合成相关的Srebp-1、Acc、Fasn mRNA的表达水平降低;且与脂肪酸氧化相关的Ppar α、Pgc-1α、Cpt-1α、Fabp-2 mRNA的表达水平显著增加,表明ESMW可以显著的降低脂质合成,增加脂质氧化。Western blot实验结果显示,ESMW显著抑制了脂质合成关键蛋白SREBP-1/ACC的活化。同时与细胞实验结果一致,ESMW可调节LKB1-AMPK-mTOR的活性。
综上,四妙丸提取物ESMW具有显著改善糖脂代谢紊乱的作用,其可通过激活AMPK、抑制脂质合成相关酶的表达,抑制脂质合成,进而抑制肝脏中的脂质蓄积。
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