摘要
通过优化姜黄素纳米晶注射液（curcumin nanocrystalline injection）处方及制备工艺，进而提高姜黄素溶出速率及体内生物利用度。采用介质研磨法制备姜黄素纳米晶，以粒径为评价指标，采用Box-Behnken实验设计优化其处方及制备工艺，并对其进行理化性质表征。此外，通过桨法对不同粒径药物溶出进行考察，并研究大鼠体内药代动力学研究。实验结果表明，通过Box-Behnken实验设计得到最优处方和工艺，获得平均粒径为223.1 nm且均一的姜黄素纳米晶。X射线衍射分析和差示扫描量热法测定结果表明，其制备过程中晶型稳定。不同粒径体外溶出实验表明其粒径越小溶出速率越快，溶出程度越高。大鼠体内药代动力学研究显示，姜黄素纳米晶注射液cmax和AUC0-∞分别是姜黄素原料药的4.9和4.1倍。综上，本研究所开发的姜黄素纳米晶注射液，制备工艺稳定，并且能够显著提高药物溶出速率和生物利用度，为姜黄素制剂研究提供了新的思路。
关键词
热射病是一种致命性急症，以高热和意识障碍为特
姜黄素是一种从姜黄中提取的色
为了提高难溶性药物姜黄素的溶解度及生物利用度，提高其成药性，本研究研制姜黄素纳米晶注射液以实现热射病的紧急救治。本研究采用介质研磨法制备姜黄素纳米晶注射液，并采用Box-Behnken设计法优化处方和工艺参数，进一步研究姜黄素纳米晶注射液的理化性质、体外释放速率和体内药代动力学行为，为姜黄素纳米晶注射液的新药研发奠定基础。
姜黄素（批号JHS20200901；纯度：98.0%，陕西益康龙生物技术有限公司）；吐温80（上海源叶生物科技有限公司）；聚乙二醇4000（PEG4000，鞍山市恒泰药用辅料制造有限公司）；泊洛沙姆188（P188）、聚乙烯醇（PVA）（日本株式会社可乐丽）；普萘洛尔（常州天华制药有限公司）；β-葡萄糖醛酸苷酶（美国Sigma公司）；其他试剂均为市售分析纯。
HJ-3磁力搅拌器（常州市金坛晨阳电子仪器厂）；C25分散乳化均质机（上海恒川机械设备有限公司）；Nano-ZS90粒度仪（英国 Malvern公司）；ECM-AP 05研磨机（华尔宝机械有限公司）；SQP电子天平（德国Sartorius公司）；透射电镜（日本Hitachi公司）；D8 Advance X射线粉末衍射仪（德国布鲁克公司）；DSC 200F3差示扫描量热仪（德国Netzsch公司）； 1200液相色谱-G6460质谱联用仪（美国安捷伦公司）；涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司）；高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；水浴恒温磁力搅拌器（常州高德仪器制造有限公司）。
称取一定量的稳定剂于250 mL烧杯中，加入纯化水100 mL搅拌溶解，再加入姜黄素20 g，再加入纯化水至200 mL，搅拌成均匀混悬液（即为物理混悬液）。将上述药液倒入湿磨机进行介质研磨，研磨介质为直径0.3 mm的氧化锆珠，研磨转速从1 500 r/min提升至3 000 r/min，然后维持不同时间，于相应时间点取样测定其粒径。
稳定剂用量在符合注射剂的要求下，分别使用吐温80（2 g）、PVA（0.4 g）、P188（2 g）、PEG4000（2 g）作为稳定剂，按照“2.1”项下方法制备姜黄素纳米晶，以粒径及多分散系数（PDI）为考察指标，筛选合适处方，并进行稳定性实验。
分别以稳定剂与原料药比例（A）、固含量（B，%）、转速（C，r/min）为考察因子，进行工艺优化。稳定剂与原料药比例设最小0.1，最大0.5。固含量是根据前期摸索的实验定的可行的范围最小10%，最大30%。转速设最小为1 500 r/min，最大3 000 r/min。以粒径为评价指标进行Box-Behnken实验。
将姜黄素、吐温80、姜黄素与吐温80的物理混合物、姜黄素纳米晶冻干粉于样品皿中用X射线衍射仪分析（管电压40 kV，管电流40 mA，在5 ~ 50°范围以0.02°/s扫描步长扫描）；并用差示扫描量热仪检测（氮气流速20 mL/min，以10 ℃/min的速度由25 ℃升至250 ℃）。
对不同粒径（200，300，500，750 nm）的姜黄素纳米晶进行溶出度的测定。精密称取不同粒径的姜黄素纳米晶（相当于姜黄素10 mg），加入到1% SDS水溶液900 mL中，桨法，转速50 r/min，温度37 ℃，经5，10，20，30，45，60 min，取样5 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤2 mL，取续滤液1 mL，HPLC测定，计算药物的累积溶出度。采用悬浮颗粒
实验前将SD大鼠禁食12 h，随机分为2组，每组各6只，给药剂量100 mg/kg，肌肉注射姜黄素纳米晶或姜黄素与吐温80的物理混合物，在给药0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，48，72，96 h后，眼眶取血约0.5 mL于抗凝管中，5 000 r/min离心10 min，分离血浆精密吸取上清液。建立的分析方法按照CFDA颁布的《生物样品定量分析方法验证指导原则》进行验证。采用经过方法学考察合格的HPLC-MS法测定血浆中姜黄素的浓度。
精密吸取大鼠血浆样品50 μL 加β-葡糖糖醛酸苷酶5 μL，涡旋30 s，在37 ℃孵育1 h，加入内标普萘洛尔（50 ng/mL）30 μL，最后加入210 μL乙腈，涡旋1 min，离心10 min（4 ℃，14 000 r/min），取上清液100 μL进样分析。计算各时间点血药浓度，绘制血药浓度-时间曲线。
以PVA、P188、PEG4000为稳定剂，分别在研磨30、10和16 min时粒径出现明显增长，且黏度增大，即发生聚集现象。以吐温80为稳定剂，研磨35 min时平均粒径为209.3 nm，且PDI在0.3以下，未发生聚集，说明吐温80作为稳定剂可得到粒径小且均一的纳米晶混悬液。以吐温80为稳定剂制备姜黄素纳米晶，放置在室温避光条件下，考察60 d的粒径及PDI变化。如
Figure 1 Particle size and polydispersity index (PDI) of curcumin nanocrystalline during storage()
将稳定剂与原料药比例（A）、固含量（B，%）、转速（C，r/min）3个影响各因素分为3个层次进行变化，共进行17次实验，5个中心点。利用 Design Expert.V8.0.61软件进行数据分析，方差分析结果显示模型的F = 34.78、P < 0.000 1，表明回归方程拟合度良好。失拟误差P = 0.128 3（P > 0.05），失拟项不显著，表明差异无统计学意义，说明数据中没有异常点，可用于姜黄素纳米晶的处方湿磨工艺优化。以粒径180 ~ 230 nm为目标，预测研磨45 min的最优处方为：稳定剂与原料药比例为0.3、固含量为10%、转速为2 000 r/min，可得到姜黄素纳米晶粒径为221.6 nm。按照最优处方工艺制备一批纳米晶，实测粒径为（223.10 ± 3.78） nm，与预测值接近，说明通过Box-Behnken实验确定的工艺条件稳定可靠，也说明建立的回归模型合理。
利用等高线图将得到的数学模型可视化，评估各参数及他们之间的相互作用对响应值的影响。等高线图（
Figure 2 Two-dimensional contour plots for curcumin nanocrystalline
A: Contour plot of ratio of Tween 80 to curcumin and solid content with respect to particle size when the rotating speed is 2 250 r/min; B: Contour plot of ratio of Tween 80 to curcumin and rotating speed with respect to particle size when the solid content is 20%
TEM扫描结果见
Figure 3 TEM of curcumin nanocrystals
由X射线衍射图谱（
Figure 4 PXRD diagrams of physical mixture of curcumin and Tween 80, Tween 80,curcumin and curcumin nanocrystals
由差示扫描量热曲线（
Figure 5 DSC diagrams of physical mixture of curcumin and Tween 80, Tween 80, curcumin and curcumin nanocrystals
不同粒径的纳米晶释药情况如
Figure 6 Dissolution curves of 200, 300, 500, 750 nm curcumin nanocrystals and physical mixture of curcumin and Tween 80 （）
取空白大鼠血浆制备成系列浓度的姜黄素标准样本。以测定姜黄素峰面积与内标峰面积比（y）为纵坐标，待测质量浓度（x）为横坐标进行线性回归，得到y = 0.002 3x+0.001 3（r = 0.998 4），表明在浓度范围内线性关系良好。
使用DAS 2.0药代动力学软件统计距法计算药代动力学参数，结果见
*P < 0.05 vs curcumin nanocrystals
Figure 7 Duration curves of curcumin nanocrystals and physical mixture （）
虽然口服给药仍然是纳米晶的主要给药途径，但当需要快速发挥药效用于急救或者存在其他不宜口服给药的情况时，肌肉注射的给药途径具有很好的优势。在此基础上，本研究开发了姜黄素纳米晶肌肉注射剂，可以减少高载药量的给药量，减少重复注射的需要。
在纳米晶的制备过程中稳定剂的稳定能力是决定纳米晶的最小粒径和物理稳定性的关键参数。在本研究中，只有吐温80能使姜黄素纳米晶在研磨过程中不聚集，且纳米晶在室温下60 d粒径及PDI稳定，故选用吐温80为稳定剂。本研究通过前期实验摸索确定处方和工艺参数范围，采用Box-Behnken实验设计法进一步优化参数，因为溶出实验证明200 nm的溶出速率要优于300 nm，故确定目标粒径为180 ~ 230 nm，得到最优处方，且姜黄素纳米晶粒径的实测值与预测值相符。
体内药代动力学研究表明，姜黄素制成纳米晶后，在大鼠体内的生物利用度能达到制备前的4.1倍，能有效提高姜黄素的生物利用度，为进一步开发难溶性药物制剂用于急救提供了参考。
References
Hifumi T，Kondo Y，Shimizu K，et al. Heat stroke［J］. J Intensive Care，2018，6：30. [百度学术]
Rong P，Meng JZ，Chen Y. Advance in pathogenesis and strategies of protective and therapeutic in heat stroke［J］. J Biomed Eng Res（生物医学工程研究），2010，29（4）：287-292. [百度学术]
Priyadarsini KI. The chemistry of curcumin：from extraction to therapeutic agent［J］. Molecules，2014，19（12）：20091-20112. [百度学术]
Odot J，Albert P，Carlier A，et al. In vitro and in vivo anti-tumoral effect of curcumin against melanoma cells［J］. Int J Cancer，2004，111（3）：381-387. [百度学术]
Ma N，Li JJ，Song LY，et al. Effects of curcumin pretreatment on the oxidative stress and apoptosis of cardiomyocytes in heatstroke rats in a dry heat environment［J］. Chin J Comp Med（中国比较医学杂志），2018，28（12）：14-18. [百度学术]
Xia L，Dong X，Kang Y，et al. Protective effects of curcumin on intestinal mucosa injury of heatstroke rats in the dry heat envrionment of desert and its effects on TLR4/NF-κB signaling pathway［J］. Prog Mod Biomed（现代生物医学进展），2017，17（34）：6648-6652. [百度学术]
Ubeyitogullari A，Ciftci ON. A novel and green nanoparticle formation approach to forming low-crystallinity curcumin nanoparticles to improve curcumin's bioaccessibility［J］. Sci Rep，2019，9（1）：19112. [百度学术]
Wang LL，Du J，Zhou YQ，et al. Safety of nanosuspensions in drug delivery［J］. Nanomed-Nanotechnol Biol Med，2017，13（2）：455-469. [百度学术]
Bala I，Bhardwaj V，Hariharan S，et al. Sustained release nanoparticulate formulation containing antioxidant-ellagic acid as potential prophylaxis system for oral administration［J］. J Drug Target，2006，14（1）：27-34. [百度学术]
Medarević D，Djuriš J，Ibrić S，et al. Optimization of formulation and process parameters for the production of carvedilol nanosuspension by wet media milling［J］. Int J Pharm，2018，540（1/2）：150-161. [百度学术]
Rabinow BE. Nanosuspensions in drug delivery［J］. Nat Rev Drug Discov，2004，3（9）：785-796. [百度学术]
Liu T，Müller RH，Möschwitzer JP. Effect of drug physico-chemical properties on the efficiency of top-down process and characterization of nanosuspension［J］. Expert Opin Drug Deliv，2015，12（11）：1741-1754. [百度学术]
Andersson SBE，Alvebratt C，Bergström CAS. Controlled suspensions enable rapid determinations of intrinsic dissolution rate and apparent solubility of poorly water-soluble compounds［J］. Pharm Res，2017，34（9）：1805-1816. [百度学术]
Zhang SW，Li XZ，Li WS，et al. Preparation and characterization of curcumin nanosuspensions［J］. Chem Ind For Prod（林产化学与工业），2016，36（2）：109-114. [百度学术]
Gigliobianco MR，Casadidio C，Censi R，et al. Nanocrystals of poorly soluble drugs：drug bioavailability and physicochemical stability［J］. Pharmaceutics，2018，10（3）：134. [百度学术]
Liu P，Rong XY，Laru J，et al. Nanosuspensions of poorly soluble drugs：preparation and development by wet milling［J］. Int J Pharm，2011，411（1/2）：215-222. [百度学术]