摘要
为探讨淫羊藿苷(icariin,ICA)对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血管舒缩功能的影响及其分子机制,采用腹腔注射200 mg/kg四氧嘧啶的方法诱导1型糖尿病小鼠模型,连续14 d灌胃给予60,120 mg/kg ICA后,考察药物对糖尿病模型小鼠血糖、体重、摄食量、饮水量的影响;分离各组小鼠的胸主动脉并检测其对乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)、硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)诱导的血管环舒张反应和对苯肾上腺素(phenylephrine,Phe)、KCl诱导的血管环收缩反应,以评价ICA对各组小鼠离体胸主动脉血管环舒缩功能的影响。为进一步探讨ICA改善血管功能的机制,采用高糖(35 mmol/L)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立细胞模型,Western blot法检测ICA对高糖诱导的HUVECs中eNOS、p-eNOS、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达的影响。结果显示,ICA显著改善糖尿病小鼠的体重下降和饮水量增多,对摄食量、血糖有一定改善作用,但无统计学差异。离体胸主动脉血管环舒缩功能实验结果显示,ICA显著改善糖尿病小鼠胸主动脉环对Phe诱导的血管环收缩和对Ach诱导的内皮依赖性血管环舒张,对KCl诱导的血管环收缩反应有一定改善但无显著性差异,对SNP诱导的非内皮依赖性血管环舒张无显著影响。Western blot实验结果显示,ICA显著抑制高糖诱导的HUVECs中p-p38 MAPK表达,促进eNOS的磷酸化激活。以上结果提示ICA可能通过抑制p-p38 MAPK表达,促进eNOS磷酸化激活,从而改善四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的血管内皮舒缩功能。
糖尿病是以胰岛素分泌不足和糖脂代谢紊乱为特征的异质性慢性代谢疾病,常伴随多种血管并发症,具有高患病率、高致残率、高致死率的特点。2020年中国成人糖尿病流行病学最新数据显
淫羊藿苷(icariin,ICA)是从传统中药淫羊藿中提取的淫羊藿总黄酮的主要有效成分之一,相对分子质量为676.662,难溶于水。ICA具有多种生物活性,如抗肿
淫羊藿苷(icariin,ICA,纯度大于98%,扬子江药业集团有限公司,批号:18102102),ICA药液配制方法:称取ICA粉末480 mg于研钵中研磨,使其溶于0.5% CMC-Na 40 mL溶液中,即为ICA高剂量混悬液,取此混悬液20 mL加入0.5% CMC-Na溶液20 mL稀释混匀即为ICA低剂量混悬液。四氧嘧啶(alloxan)、硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)、氯化乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)(Macklin公司);盐酸去氧肾上腺素(phenylephrine,Phe,Aladdin公司);氯化钾(上海凌峰化学试剂有限公司);p38 MAPK、GAPDH抗体(Protein Tech公司);p-p38 MAPK抗体(美国Cell Signaling Technology公司);eNOS抗体(沈阳万类生物有限公司);p-eNOS抗体(百远生物科技有限公司)。其他试剂均为市售分析纯。
雄性昆明种小鼠24只,体重18 ~ 22 g,适应性饲养1周后随机挑选6只小鼠作为正常对照组(control),其余小鼠用于造模。造模方法:将所有待造模小鼠禁食不禁水12 h后,按200 mg/kg的剂量腹腔注射2%四氧嘧啶溶液(将四氧嘧啶溶于无菌生理盐水,现用现配),对照组小鼠注射等同体积的生理盐水。造模72 h后,将所有小鼠禁食不禁水8 h,取小鼠尾静脉血用血糖仪测定小鼠空腹血糖,随即挑选血糖大于等于11.1 mmol/L的小鼠纳入糖尿病模
将造模成功的糖尿病小鼠随机分为3组:模型组(model)、ICA低剂量组(ICA-L,60 mg/kg)和ICA高剂量组(ICA-H,120 mg/kg)。每日灌胃给药1次,ICA的给药容积为0.1 mL/10 g体重,连续给药2周。
分别于给药前、给药2周后用血糖仪测定各组小鼠的空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)。每日记录各组小鼠体重,计算各组小鼠的摄食量和饮水量,观察各组小鼠的体重、摄食量和饮水量变化情况。
各组小鼠脱颈椎处死后,分离胸主动脉并立即置于预冷(4 ℃)的K-H液中,去除外周结缔组织并分离周围脂肪后将血管剪成3 ~ 4 mm长的动脉环,小心地将其穿于2根不锈钢钩上,再悬挂于盛有K-H液的浴皿内,下端钢丝用另一不锈钢钩固定,上端连接张力换能器,浴皿中持续通入O2,气泡以每秒3 ~ 5个为宜,连接恒温水槽以保持(37 ± 0.5)℃的恒温状态,将张力换能器连接至多道生理记录仪,调节胸主动脉血管环静息张力为500 mg后,每隔15分钟更换一次K-H液进行平衡,平衡1 h后向浴皿中加入Phe(1 × 1
各组小鼠动脉环平衡后,向浴皿中加入Phe(1 × 1
各组小鼠动脉环平衡后,向浴皿中加入Phe(1 × 1
各组小鼠动脉环平衡后,分别累计加入不同浓度的Phe,使浴皿中Phe的终浓度分别为1 × 1
选取对数生长期的HUVECs细胞,接种于6孔板中,贴壁后换为无血清的RPMI 1640培养基饥饿24 h。细胞分为4组:正常组(Control)、高糖组(35 mmol/L高糖,HG)、ICA-L(35 mmol/L HG + 10 μmol/L ICA)、ICA-H(35 mmol/L HG + 30 μmol/L ICA),分别用高糖和ICA处理48 h后收集细胞,经RIPA裂解液裂解细胞15 min,12 000 r/min离心10 min,吸取上清液,使用BCA试剂盒进行蛋白定量,根据蛋白定量结果将4组细胞裂解液浓度调至一致,分别加入5 × SDS PAGE上样缓冲液,涡旋混匀,金属浴95 ℃煮10 min。蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳,通过湿转法将蛋白转移至PVDF膜后置于10%脱脂牛奶中室温封闭2 h;TBST洗去牛奶后,先后孵育抗eNOS(1∶1 000)、p-eNOS(1∶1 000)、p38 MAPK(1∶1 000)、p-p38 MAPK(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)。用高敏ECL发光液孵育条带并显影,采集的图片采用Image J软件进行灰度分析。蛋白表达量采用灰度校正值显示(各条带灰度/GAPDH灰度)。
与正常组小鼠相比,模型组小鼠的体重自给药第2天开始逐渐降低,给药2周后较正常组极显著性降低(P < 0.001),ICA高低剂量组均明显抑制小鼠体重减轻(P < 0.001),结果见

Figure 1 Effect of icariin on body weight in alloxan-induced diabetic mice ()ICA-L: 60 mg/kg; ICA-H: 120 mg/kg
*P < 0.05,
给药2周后,与正常组相比,模型组小鼠的空腹血糖、摄食量和饮水量均有明显增加。ICA-L和ICA-H组可以显著改善糖尿病小鼠的饮水量增多,对空腹血糖和摄食量有一定改善作用,但无统计学差异,结果见
*P < 0.05,
与正常组相比,糖尿病小鼠胸主动脉对Ach诱导的内皮依赖性舒张显著降低(P < 0.001);与模型组相比,ICA(60 mg/kg)给药后可以一定程度上提高Ach诱导的糖尿病小鼠胸主动脉舒张率,但无统计学差异;ICA(120 mg/kg)给药后显著改善Ach诱导的糖尿病小鼠胸主动脉舒张反应(P < 0.01),结果见

Figure 2 Effect of icariin on Ach induced vasodilation of aortas in alloxan-induced diabetic mice()
***P < 0.001 vs control group;
ICA对SNP诱导的小鼠胸主动脉舒张试验结果显示,各组之间不同诱导剂量的舒张率无显著性差异,说明四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血管非内皮依赖性舒张反应受损不明显(P > 0.05),结果见

Figure 3 Effect of icariin on sodium nitroprusside (SNP) induced vasodilation of aortas in alloxan-induced diabetic mice ()
与正常组相比,模型组、ICA-L和ICA-H组小鼠随诱导剂量的增加收缩率逐渐上升,差异具有极显著性(P < 0.001)。与模型组相比,ICA(60 mg/kg)给药后可以一定程度上降低Phe诱导的糖尿病小鼠胸主动脉收缩率,但无统计学差异(P > 0.05);ICA(120 mg/kg)给药后显著降低Phe诱导的糖尿病小鼠胸主动脉收缩(P < 0.05);说明ICA(120 mg/kg)可以改善糖尿病状态下Phe诱导的小鼠胸主动脉收缩,结果见

Figure 4 Effect of icariin on phenylephrine (Phe) induced vascular contraction response of aortas in alloxan-induced diabetic mice ()
***P < 0.001 vs control group;
ICA对KCl诱导的雄性小鼠胸主动脉收缩效应的影响试验结果显示,与正常组相比,模型组小鼠胸主动脉随KCl诱导剂量的增加收缩率逐渐升高,呈极显著性差异(P < 0.001)。ICA-L和ICA-H组小鼠胸主动脉对KCl诱导的收缩功能有一定改善作用,但无统计学差异(P > 0.05),结果见

Figure 5 Effect of icariin on KCl induced vascular contraction response of aortas in alloxan-induced diabetic mice ()
***P < 0.001 vs control group
Western blot结果显示,各组之间p38 MAPK和eNOS的总蛋白含量无明显差异。与正常组比较,高糖组p-p38 MAPK蛋白表达显著升高(P < 0.05),p-eNOS蛋白表达显著降低(P < 0.05);与高糖组相比,ICA(10 μmol/L)给药组的p38 MAPK磷酸化水平有所降低,但无统计学差异(P > 0.05),eNOS磷酸化水平上调(P < 0.05);ICA(30 μmol/L)给药组可以显著抑制高糖诱导的p38 MAPK磷酸化(P < 0.01),并且显著提高eNOS的磷酸化水平(P < 0.001),结果见

Figure 6 Effect of icariin on p38 MAPK/eNOS signaling pathway in high glucose-induced HUVECs ()
*P < 0.05 vs control group;
糖尿病导致的微血管和大血管并发症是导致糖尿病患者发病率和病死率升高的主要原
eNOS主要表达于内皮细胞,负责产生NO,扩散至下层血管平滑肌细胞引起松弛效
综上所述,ICA可能通过抑制p-p38 MAPK表达,提高内皮细胞中eNOS的磷酸化水平,进而改善糖尿病状态下小鼠胸主动脉的血管舒缩功能,ICA有望成为治疗糖尿病血管病变的潜在药物。
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