摘要
建立气相色谱法测定聚西托醇1000中残留的环氧乙烷、1,4-二氧六环、乙二醇、二甘醇和三甘醇等杂质,为聚西托醇1000生产质量控制提供参考。采用DB-1色谱柱检测环氧乙烷和1,4-二氧六环,顶空进样,进样口温度150 ℃,检测器温度250 ℃,顶空平衡温度70 ℃,平衡时间45 min。采用VF-17MS色谱柱检测乙二醇、二甘醇和三甘醇,液体进样,进样口温度270 ℃,检测器温度290 ℃。实验结果显示,环氧乙烷和1,4-二氧六环在各加样量范围内线性良好(r > 0.999),精密度RSD小于8.0%,平均回收率分别为90.6%和101.2%;乙二醇、二甘醇和三甘醇在3 ~ 60 μg/mL内线性关系良好(r > 0.999),精密度RSD小于3.0%,回收率均在96% ~ 103%。本研究所建立的方法具有良好的专属性、线性、精密度和回收率,能够有效检测聚西托醇1000中多组分极微量杂质。
聚西托醇1000(又称聚乙二醇十六烷基醚),是一种常见的药用辅料,化学式为CmH2m+1(OCH2CH2)nOH(m = 16,n ~ 20),本品由十六醇与一定数量的环氧乙烷通过缩合反应制得,产品中聚乙二醇的重复单元在2 ~ 20之间,当n = 20时即为聚西托醇1000(商品名Brij-58
在聚西托醇1000的生产中,环氧乙烷作为主要原料可能残留于产物中,与其相关的副产物还包括1,4-二氧六环、乙二醇及其次级副产物二甘醇和三甘醇等。环氧乙烷对黏膜和皮肤具有一定的刺激性,是世界卫生组织列出的一类致癌物,短时间内少量吸入即可引起明显的中枢神经毒
现行聚西托醇1000的质量标准主要收载于英国药典BP202
Trace 1300气相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)配备氢火焰离子化检测器(FID)及自动进样器;SECURA25-1CN、BSA124S电子天平(德国Sartorius公司);VF-17MS气相色谱柱(30 m × 0.53 mm,1 μm),DB-1气相色谱柱(30 m×0.32 mm,5 μm)(美国安捷伦科技有限公司);Omni-A独立超纯水系统(厦门瑞思捷科学仪器有限公司)。
乙二醇(纯度 ≥ 99.5%,批号:L1902032)、二甘醇(纯度 ≥ 99.5%,批号:H1814132)、乙醇(色谱级,纯度 ≥ 99.5%,批号:J2027121)、乙醛(纯度 ≥ 99.5%,批号:E2107134)、N,N-二甲基乙酰胺(色谱级,纯度 ≥ 99.9%,批号:A2115160)、1,4-二氧六环标准品(纯度 ≥ 99.7%,批号:L2011016)(上海阿拉丁试剂有限公司);三甘醇(纯度 ≥ 99.0%,批号:L1712031)、1,3-丁二醇(纯度 ≥ 99.0%,批号:ZLCGF-DM)(上海梯希爱化成工业发展有限公司);环氧乙烷水溶液(1.85 mg/mL,中国食品药品检定研究院,批号:190255-202001);聚西托醇1000样品由生产企业赠送(A公司,批号记为A1、A2、A3、A4和A5;B公司,批号记为B1、B2和B3)。
供试品溶液:取本品1.0 g,精密称定,置于顶空瓶中,精密加入N,N-二甲基乙酰胺1.0 mL和水0.2 mL,密封,摇匀,作为供试品溶液。
环氧乙烷对照品储备液:精密量取环氧乙烷水溶液0.15 mL于25 mL量瓶中,用水定容得质量浓度为11.1 μg/mL的溶液。
1,4-二氧六环对照品储备液:精密称取1,4-二氧六环50 mg于50 mL量瓶中,用水稀释成约1 mg/mL的溶液。再精密量取1 mL于20 mL量瓶中,用水定容得质量浓度为50 μg/mL的溶液。
对照品混合储备液:精密称取1,4-二氧六环50 mg于20 mL量瓶中,用水稀释成约2.5 mg/mL的溶液,精密量取0.5 mL于25 mL量瓶中,另精密量取环氧乙烷水溶液0.15 mL于该量瓶中,用水定容得环氧乙烷质量浓度为11.1 μg/mL同时1,4-二氧六环质量浓度为50 μg/mL的对照品混合储备液。
对照品溶液:取本品1.0 g,精密称定,置于顶空瓶中,精密加入环氧乙烷和1,4-二氧六环对照品储备液各0.1 mL,再精密加入N,N-二甲基乙酰胺1.0 mL,密封,摇匀。
系统适用性溶液:精密量取环氧乙烷和1,4-二氧六环对照品溶液各0.1 mL置于顶空瓶中,加入新配制的0.001%乙醛水溶液0.1 mL,再精密加入N,N-二甲基乙酰胺1.0 mL,密封摇匀。
使用安捷伦DB-1色谱柱(以聚二甲基聚硅氧烷为固定液的石英毛细管柱(30 m×0.32 mm, 5 μm)),顶空进样。起始温度为35 ℃,维持5 min,以5 ℃/min升温至180 ℃,再以30 ℃/min升温至230 ℃,维持5 min。进样口温度为150 ℃,氢火焰离子化检测器温度为250 ℃,顶空平衡温度为70 ℃,平衡时间45 min。进样体积1000 μL,分流比5∶1。取样品注入气相色谱仪,按标准加入法计算。
取空白溶剂(N,N-二甲基乙酰胺1.0 mL加水0.2 mL的混合溶液)、系统适用性溶液和供试品溶液顶空进样分析,检测结果见

Figure 1 Chromatograms of blank solution(A), system suitability solution(B) and reference solution(C)
1: Acetaldehyde; 2: Ethylene oxide; 3: 1,4-Dioxane
称量样品1.0 g,精密称定6份置于顶空瓶中。依次精密移取对照品混合储备液各0、0.10、0.20、0.30、0.40和0.50 mL于顶空瓶中,并再往第一份和第二份样品中分别补加水0.2 mL和0.1 mL。然后按顺序依次精密量取N,N-二甲基乙酰胺1.0、1.0、1.0、0.9、0.8、0.7 mL加至顶空瓶内,密封摇匀,得到线性测试溶液:环氧乙烷加样量分别为0、0.555、1.11、1.665、2.22和2.775 μg/g;1,4-二氧六环加样量分别为0、2.512、5.023、7.535、10.046和12.558 μg/g。每个加样量组平行配制3份溶液,取上述溶液进样分析,以各样品峰面积对加样量(μg/g)作图并进行线性拟合。检测结果见
结果显示,环氧乙烷在0 ~ 2.775 μg/g的加样范围内线性良好,在各加样量下的RSD均小于6%,线性方程y = 0.035 1x - 0.000 7,r = 0.999 5;1,4-二氧六环在0 ~ 12.558 μg/g的加样范围内线性良好,在各加样量下的RSD均小于9%,线性方程y = 0.009 9x - 0.001 9,r = 0.999 4。
取样品约1.0 g,精密称定于顶空瓶中,分别加入不同体积的环氧乙烷对照品储备液和1,4-二氧六环对照品储备液,补足水至水相体积到0.2 mL后,各精密量取1.0 mL的N,N-二甲基乙酰胺加入顶空瓶,配制成含有不同环氧乙烷和1,4-二氧六环加样量的溶液,进样分析。当信噪比为3和10时,分别为仪器对环氧乙烷和1,4-二氧六环的检测限定量限。结果显示,环氧乙烷的检测限(S/N = 3)为0.222 μg/g,定量限(S/N = 10)为0.888 μg/g,1,4-二氧六环的检测限(S/N = 3)为1.501 μg/g,定量限(S/N = 10)为3.503 μg/g。
称量聚西托醇1000样品(B1)1.0 g共6份,精密称定,置于顶空瓶中。依次分别加入环氧乙烷对照品储备液和1,4-二氧六环对照品储备液各0.10 mL,然后依次精密量取N,N-二甲基乙酰胺1.0 mL加入顶空瓶,密封摇匀,配制成环氧乙烷加样量为1.11 μg/g及1,4-二氧六环加样量为5.023 μg/g的回收率溶液。另取样品1.0 g,精密称定,置于顶空瓶中,精密加入水0.2 mL和N,N-二甲基乙酰胺1.0 mL加至顶空瓶内,用于测量空白本底值。将各溶液进样分析,检测结果见
结果显示,在该加样水平下,环氧乙烷平均回收率为90.6%,1,4-二氧六环平均回收率为101.2%,环氧乙烷和1,4-二氧六环的RSD均小于8.0%,符合《中华人民共和国药典》(2020版)要求。
内标溶液:取1,3-丁二醇适量,精密称定,加无水乙醇配制成质量浓度为4 mg/mL的内标溶液。
对照品储备溶液:取乙二醇、二甘醇和三甘醇适量,精密称定,用无水乙醇溶解并稀释制成各样品浓度均为4 mg/mL的混合溶液。
对照品溶液:精密移取对照品储备溶液1.0 mL,置100 mL量瓶中,精密移取内标溶液1.0 mL,用无水乙醇稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。
供试品溶液:取本品4.0 g,精密称定,置100 mL量瓶中,精密加内标储备液1.0 mL,用无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
线性对照品溶液:称量乙二醇、二甘醇和三甘醇适量,精密称定,用无水乙醇溶解并稀释成各样品浓度均为0.75 mg/mL的线性对照品溶液。
线性内标溶液:取1,3-丁二醇适量,精密称定,加无水乙醇配制成质量浓度为1 mg/mL的内标溶液。
回收率对照品溶液:称量乙二醇、二甘醇和三甘醇适量,精密称定,用无水乙醇溶解并稀释成各样品质量浓度均为1.25 mg/mL的线性对照品溶液。
回收率内标溶液:取1,3-丁二醇适量,精密称定,加无水乙醇配制成质量浓度为1 mg/mL的内标溶液。
使用安捷伦 VF-17MS色谱柱(以50%苯基-50%甲基聚硅氧烷为固定液的石英毛细管柱(30 m×0.53 mm, 1 μm)),液体进样;起始温度60 ℃,维持5 min,以5 ℃/min升温至110 ℃,维持5 min,再以2 ℃/min升温至170 ℃,维持5 min,再以35 ℃/min升温至280 ℃,维持30 min。进样口温度为270 ℃,氢火焰离子化检测器温度为290 ℃。取对照品溶液作为系统适用性溶液进样,要求乙二醇、二甘醇和三甘醇色谱峰之间的分离度不得小于2.0。载气为氮气,分流比2∶1,流速4 mL/min,进样体积1.0 μL。取供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪,按内标法以峰面积计算。
分别取空白溶剂(无水乙醇)、对照品溶液、供试品溶液进样分析,结果见

Figure 2 Chromatograms of blank solution (A), reference solution (B) and mixture of sample and reference solution (C)
1: Ethylene glycol; 2: 1,3-Butanediol; 3: Diethylene glycol; 4: Triethylene glycol
依次精密移取0.1、0.5、1、1.5和2 mL线性对照品溶液于25 mL量瓶中,再各精密加入线性内标溶液1.0 mL,加无水乙醇定容得到线性测试溶液,其中1,3-丁二醇质量浓度均为40.168 μg/mL,乙二醇分别为3.009、15.046、30.092、45.138和60.184 μg/mL,二甘醇分别为3.047、15.236、30.472、45.708和60.944 μg/mL,三甘醇分别为3.016、15.082、30.164、45.246和60.328 μg/mL。以各样品与内标峰面积之比对各样品浓度作图,并进行线性拟合。
结果显示,乙二醇在3.009 2 ~ 60.184 0 μg/mL的范围内线性良好,线性方程为y = 0.016 2x -0.010 9,r = 0.999 5;二甘醇在3.047 2 ~ 60.944 0 μg/mL的范围内线性良好,线性方程为y = 0.016x - 0.015 1,r = 0.999 7;三甘醇在3.016 4 ~ 60.328 0 μg/mL的范围内线性良好,线性方程为y = 0.014x - 0.030 9,r = 0.999 4。
取不同体积的对照品储备溶液于100 mL量瓶中,用无水乙醇稀释至不同浓度,当信噪比为3和10时,分别为各样品的检测限和定量限。结果显示,乙二醇的检测限(S/N = 3)为1.942 μg/mL,定量限(S/N = 10)为5.665 μg/mL;二甘醇的检测限为1.567 μg/mL,定量限为3.254 μg/mL;三甘醇的检测限为1.112 μg/mL,定量限为3.567 μg/mL;1,3-丁二醇的检测限为0.707 μg/mL,定量限为1.768 μg/mL。
取聚西托醇1000样品(B1批)1.0 g共9份分成3组,精密称定,置25 mL量瓶中,精密加入回收率内标溶液1.0 mL,再分别精密量取回收率对照品溶液0.4、0.5和0.6 mL加入量瓶中,用无水乙醇稀释至刻度,配制成低(20 μg/mL)、中(25 μg/mL)和高(30 μg/mL)3种质量浓度的回收率供试溶液。
另取样品(B1批)1.0 g,精密称定,置于25 mL量瓶中,精密移取1.0 mL回收率内标溶液后加无水乙醇溶解并稀释至刻度,用于测量空白本底值。另精密量取回收率对照品溶液0.5 mL至25 mL量瓶中,精密加入回收率内标溶液1 mL,加无水乙醇定容,用于测量校正因子。将各溶液分别进样分析,检测结果见
结果显示,各加样浓度下,乙二醇回收率均在101% ~ 103%,二甘醇回收率均在96% ~ 103%,三甘醇回收率均在100% ~ 103%,RSD均小于3.0%,均符合《中华人民共和国药典》(2020版)要求。
取共8批次样品按照“2.2.1”项下的方法配制供试品溶液和对照品溶液,并照“2.2.2”项下色谱条件进样分析,按内标法以峰面积计算各批次样品中乙二醇、二甘醇和三甘醇的含量。检测结果见
NA: the detection limit has not been reached. The LOD of ethylene glycol, diethylene glycol and triethylene glycol is 1.942 μg/mL, 1.567 μg/mL and 1.112 μg/mL, respectively
结果显示,8批样品中,A1和A2批次乙二醇、二甘醇和三甘醇含量相对于其他批次较大,其余批次乙二醇、二甘醇和三甘醇含量均小于0.01%。
本研究所建立的检测方法主要参考了《中华人民共和国药典》中部分与聚西托醇1000化学结构及制备工艺相似品种的现行检测方法,并在其基础上加以改进使其更适合本品的检测,参考品种包括聚乙二醇1000、聚氧乙烯50硬脂酸酯和聚氧乙烯油酸酯等。
检测过程中发现,在参考品种所规定的杂质限度下,由于环氧乙烷和1,4-二氧六环的对照品溶液浓度较低,两者的对照溶液进样后峰面积均较小,信噪比低难以达到仪器的定量限,重复性和线性较差。因此通过调整进样分流比至5∶1,实现了在不提高样品浓度情况下使目标峰可稳定达到仪器检测限,各杂质峰均满足检测要求。
本研究建立了适用于聚西托醇1000中环氧乙烷、1,4-二氧六环、乙二醇、二甘醇和三甘醇等残留杂质的气相色谱检测方法,所建立的方法具有良好的专属性、线性、精密度和回收率,检测灵敏度高,涵盖的杂质种类多。同时,本研究还通过测定收集到的8批样品中的残留杂质,为聚西托醇1000残留杂质的检测和限度控制提供了参考依据,为药用辅料质量标准的建立提供了理论支撑。
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