摘要
采用大鼠尘肺模型,探讨β-烟酰胺单核苷酸(NMN)对呼吸肌功能的改善作用及线粒体相关机制。通过气管注射石英粉尘建立大鼠慢性尘肺模型,造模3个月后,治疗组灌胃给予NMN 300,150 mg/kg,给药4周后进行各项指标检测。结果显示,尘肺模型大鼠出现明显的呼吸异常和通气障碍,表现为呼吸频率增加,呼吸幅度下降(P < 0.01),血液pH、PaO2和SaO2均显著降低,而PaCO2显著升高(P < 0.01),NMN 给药可以明显改善模型大鼠的呼吸功能,增加血氧饱和度。NMN可明显增强离体膈肌的收缩功能和ATP含量,改善肌肉疲劳状态(P < 0.05,P < 0.01)。尘肺大鼠膈肌线粒体膜电位显著降低(P < 0.01),琥珀酸脱氢酶(SDH)活力显著下降(P < 0.01),同时超氧化物歧化酶(SOD)活力下降、丙二醛(MDA)水平增加(P < 0.05),表明膈肌线粒体氧化代谢障碍和氧化应激损害,NMN对这些膈肌线粒体功能相关改变具有明显的改善。NMN可以显著上调尘肺大鼠膈肌Sirt1、Pgc-1α、Nrf1和Tfam等线粒体生物发生相关基因的mRNA水平。结果表明,NMN灌胃给药可以调节尘肺模型大鼠膈肌线粒体功能,改善膈肌能量代谢,增强膈肌收缩功能,进而改善呼吸和通气状态,此作用可能是通过促进膈肌线粒体生物发生而介导的。
关键词
尘肺病是我国职业病患者中最大的群体,尘肺病一旦发生,呈进行性发展,严重降低患者劳动能力和生活质量,且给国家造成巨大的经济损失,迄今国内外均没有针对尘肺病纤维化有效的治疗药物和措
呼吸肌疲劳的治疗,目前主要有机械通气、药物、呼吸肌训练等。茶碱类、咖啡因等药物有增强呼吸肌收缩力的作用,但缺乏确切的临床疗效数据,且长期应用不良反应发生率较高;此外,机械辅助通气属于短期对症治疗,长期应用的难度很大且不良反应发生率较
以膈肌为主的呼吸肌属于骨骼肌,是高能量需求组织,也是机体中线粒体含量最高的组织之一。在线粒体的呼吸功能方面,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NA
β-烟酰胺单核苷酸(NMN,纯度大于95%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);石英粉(粒径小于5 μm,江苏联瑞新材料股份有限公司),采用生理盐水制备成50 mg/mL悬液供造模用。无菌生理盐水(辰欣药业股份有限公司);琥珀酸脱氢酶(SDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)等生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)。线粒体分离试剂盒和线粒体膜电位(JC-1)检测试剂(碧云天生物技术有限公司);组织ATP检测试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司);其余试剂均为市售分析纯。
BS210S精密电子天平(德国Sartorius公司);TL系列中高通量组织细胞研磨破碎仪(北京鼎昊源科技有限公司);BL-420F生物机能系统(成都泰盟软件有限公司);i-STAT血气分析仪及CG4+芯片(美国雅培床旁监护有限公司);VarioskanLux多功能酶标仪,AppliedBiosystemsStepOn
参考《职业卫生标准制定指南》及文献方法,将研磨过的石英粉(99%粉尘颗粒直径≤5 μm)用生理盐水制备成50 mg/mL混悬液,供造模用。
SD大鼠麻醉卧位固定,于颈部切口,分离肌肉,暴露气管,将石英粉尘混悬液1 mL经气管慢速注入(10 s),注射完毕竖立大鼠,保持大鼠直立体位,并按摩双肺10次,使粉尘进入肺内并均匀分布。注射完毕,缝合颈部肌肉和皮肤,标记并分笼饲养。根据前期实验结果,采用本方法约在造模后3个月左右出现明显的肺纤维化及呼吸状态改变,肺组织病理检查可见中度的肺泡炎(HE染色)和肺纤维化(Masson染色),接近尘肺病病变特
取上述造模大鼠48只,根据体重随机分为以下3组:模型组(生理盐水)、NMN 300 mg/kg、NMN 150 mg/kg;另取16只正常大鼠作为空白对照组。大鼠灌胃给药,每天1次,每周给药6 d,连续给药4周,给药体积均为1 mL/kg。
每天给药前,观察大鼠毛色、行为、运动等一般状态,重点观察呼吸系统的相关症状,包括:呼吸困难,腹式呼吸,喘息,呼吸暂停,紫绀,呼吸急促,鼻分泌物等。每周测定体重1次,并根据体重调整给药量。
于给药4周后,进行呼吸功能测定。大鼠采用戊巴比妥钠(30 mg/kg)注射麻醉,仰卧固定,在剑突连线于肌力换能器,并连于生物机能实验系统上,用张力4.9 × 1
每组取大鼠8只,断头处死,开胸速取膈肌,包括中心腱及部分肋骨,置于充满Kreb's液(NaCl 135 mmol/L,CaCl2 2.5 mmol/L,MgSO4 1 mmol/L,NaH2PO4 1 mmol/L,NaHCO3 15 mmol/L,KCl 5 mmol/L,葡萄糖 11 mmol/L,pH 7.3 ~ 7.4)的玻璃平皿中,持续通入95% O2和5% CO2混合气体。每块膈肌沿中心腱分成两半,右半膈肌去除肋骨中心腱脂肪及结缔组织,用冷磷酸缓冲液(PBS)洗去血液,滤纸吸干称重备生化测定用。左半膈肌中部剪出1条0.4 cm × 1.5 cm的肌条,参考文献方法进行膈肌张力及疲劳测定,记录张力-频率曲线,并计算疲劳指数(fatigue index,FI
每组取大鼠8只冻存膈肌组织,常规制备组织匀浆,取上清液检测超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及琥珀酸脱氢酶(SDH)活性变化,考察膈肌组织的氧化应激状态。
每组取大鼠8只冻存膈肌组织,采用Real time PCR检测线粒体生物发生信号分子的mRNA表达水平,包括:沉默信息调节因子1(Sirt1),过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(Pgc-1α),核呼吸因子1(Nrf1),线粒体转录因子A(Tfam)。引物序列见
Real time PCR检测:Trizol一步法提取组织总RNA,按照逆转录试剂盒说明书,37 ℃孵育15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 2 min,获得的cDNA样品-80 ℃保存。取96孔PCR板,依次加入下列成分(总体积20 μL):EvaGreensupermix 10 μL,混合引物(10 μmol/L)1 μL,cDNA 1 μL,超纯水8 μL。涡旋混匀,1 500 r/min,离心2 min,按下列循环条件反应:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s/60 ℃,10 s,40个循环;65 ℃ ~ 95 ℃,10 min。
给药期间各组大鼠精神状态较好,模型组部分大鼠可见呼吸频率有所增加,其他未见明显异常。与正常对照组相比,模型大鼠体重接近,NMN给药对大鼠体重亦未见明显影响(
与正常对照组相比,模型大鼠呼吸状态出现明显改变,呼吸频率增加而呼吸幅度下降(P < 0.01),提示呼吸功能的显著改变。NMN给药可以明显改善模型大鼠的呼吸状态,300 mg/kg组呼吸频率和呼吸幅度均有明显改善(P < 0.05)(
**P < 0.01 vs control group;
如
PaCO2:Partial pressure of carbon dioxide in artery;PaO2: Partial pressure of oxygen in artery; SaO2:Oxygen saturation;1 mmHg = 133.3 Pa
分别记录10,20,40,60,100 Hz刺激下的膈肌收缩力,并采用肌肉横截面积(CSA)进行数据校正,绘出张力-频率曲线(

Figure 1 Effects of NMN (ig) on contractility (A) and fatigue index (B) of isolated diaphragm in pneumoconiosis rats ()
**P < 0.01 vs control group;
与正常大鼠相比,尘肺模型大鼠膈肌ATP含量和线粒体膜电位(ΔΨm)均显著降低(P < 0.01),提示膈肌出现能量代谢障碍和线粒体功能异常,NMN 300 mg/kg具有明显改善作用(P < 0.05),而150 mg/kg组的病变也可见一定的减轻(

Figure 2 Effects of NMN (ig) on ATP content and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) of diaphragm in pneumoconiosis rats ()
**P < 0.01 vs control group;
与正常对照组相比,模型组大鼠膈肌琥珀酸脱氢酶(SDH)活力显著下降(P < 0.01),提示线粒体氧化代谢功能障碍。同时超氧化物歧化酶(SOD)活力下降、丙二醛(MDA)水平增加(P < 0.05),表明膈肌组织出现明显的氧化应激损害。NMN灌胃给药可以显著增加模型组大鼠膈肌SDH和SOD活力,同时降低MDA水平(
*P < 0.05
与正常大鼠相比,尘肺模型大鼠膈肌组织Sirt1、Pgc-1α、Nrf1和Tfam等线粒体生物发生相关基因的mRNA水平均显著下调(P < 0.01),NMN高、低剂量组灌胃给药可以显著上调模型组大鼠膈肌中线粒体生物发生相关基因表达(P < 0.05,P < 0.01)(

Figure 3 Effects of NMN (ig) on mRNA expression levels of mitochondrial biogenesis related genes of diaphragm in pneumoconiosis rats ()
**P < 0.01 vs control group;
尘肺是伴有进展性和实质性肺组织损害的严重肺部疾病,以膈肌为主的呼吸肌是尘肺长期呼吸障碍状态下的易损器官。
本研究采用的尘肺模型出现明显的呼吸状态改变(呼吸频率增加,呼吸幅度下降),同时呼吸通气功能也显著抑制(血液pH、PaO2和SaO2均显著降低,而PaCO2显著升高),与既往研究一
多项研究发现线粒体异常可造成慢性阻塞性肺病患者骨骼肌功能障碍,包括呼吸肌疲劳和外周骨骼肌萎
骨骼肌可通过线粒体生物发生(mitochondrial biogenesis)调节线粒体数量和功能,进而适应组织能量代谢的变
综上,本研究结合当前尘肺病临床防治需求和NMN药理作用特点,通过大鼠尘肺模型,考察NMN对呼吸肌疲劳的改善作用及相关机制。结果表明,NMN灌胃给药可以调节尘肺模型大鼠膈肌线粒体功能,改善膈肌能量代谢,增强膈肌收缩功能,进而改善呼吸和通气状态,此作用可能通过SIRT1/PGC-1α/NRF1、TFAM途径促进膈肌线粒体生物发生而介导。多项研究表明,增强线粒体功能是运动锻炼改善骨骼肌功能的重要机
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