摘要
利用神经特异性荧光剂作为动物的神经标志物用于指导手术操作,可降低术中神经损伤的发生率。本研究在嗪母核结构的基础上进行结构修饰,通过质谱和核磁共振氢谱证实得到一系列
嗪衍生物荧光染料YQN-3~YQN-6,以突出大鼠的周围神经结构。在一系列靶向荧光染料中,YQN-3在NIR附近具有发射峰值,静脉注射4 h后在臂丛神经和坐骨神经中显示出高特异性神经靶向信号。此外,在甲状腺切除术中,YQN-3能精准定位并识别出喉返神经,从而在术中保留这些神经的完整性。YQN-3合成工艺简单,毒性小,具有潜在的临床神经组织显像应用前景。
外科手术是大多数疾病和损伤最有效的治疗选择,全世界每年有超过3亿次手
临床中,喉返神经的医源性损伤是一种常见的甲状腺术后并发症,通过肉眼识别进而保护喉返神经是甲状腺手术中保证喉返神经安全的金标
MBP是神经髓鞘的主要成分,在形成和维持髓磷脂的稳定中起着至关重要的作用,对于神经系统的正常功能非常重
本研究中在𫫇嗪类化合物母核结构基础上进行结构修饰,得到了YQN-3~YQN-6 4个化合物,其结构经质谱和核磁共振氢谱确证,并且其最大吸收和最大发射波长分别在625 nm和640 nm左右,具有较好的光谱性质。进一步在大鼠中筛选出具有神经组织高特异性靶向的YQN-3,最后在甲状腺手术切除过程中验证了,探针YQN-3具有喉返神经特异性靶向能力,能很好地靶向、定位喉返神经,有效地避免术中损伤。YQN-3具有良好的安全性,具有潜在的临床神经显影应用前景。
高氯酸(70%)、二甲基亚砜、高氯酸𫫇嗪4(阿拉丁生化科技股份有限公司);叔丁醇钾、间羟基-N,N-二乙基苯胺、间溴苯甲醚(毕得医药科技股份有限公司);四(三苯基膦)钯(阿达玛斯试剂有限公司);环丁胺、环己胺(分析纯,迈瑞尔化学技术有限公司);水合氯醛(分析纯,贤鼎生物科技有限公司);胎牛血清(生物级,美国赛默飞世尔科技公司);Cell Counting Kit-8(碧云天生物技术有限公司);聚氧乙烯氢化蓖麻油(源叶生物科技有限公司);DMEM培养基、胰蛋白酶(生物级,凯基生物技术有限公司)。
Hei-VAP Core型旋转蒸发仪(德国海道夫有限公司);Avance-400型核磁共振波谱仪(德国布鲁克公司);6540-ESI-MS型高分辨质谱仪(美国安捷伦科技公司);UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津仪器有限公司);F-4700型荧光光谱仪(日本日立有限公司);IVIS Lumia Ⅲ小动物活体成像仪(美国珀金埃尔默公司);Leica CM1950型冷冻切片机(德国徕卡有限公司);ELx800型酶标仪(美国伯腾有限公司)。
化合物YQN-3 ~ YQN-6的合成路线示意图如路线1所示。

Scheme 1 Synthetic route of YQN-3-YQN-6
步骤一:25 mL三颈瓶中,加入间溴苯甲醚1.50 g(8.02 mmol),环丙胺0.73 g(12.79 mmol),叔丁醇钾1.36 g(12.12 mmol),四(三苯基膦)钯0.05 g(0.043 mmol)和甲苯(8 mL),氮气保护下80 ℃加热反应8 h。降至室温后将反应液旋干、硅胶柱色谱纯化,可得到棕色油状液体N-环丙基-3-甲氧基苯胺。MS,m/z:164.14。
步骤二:取将步骤一得到的N-环丙基-3-甲氧基苯胺200 mg(1.23 mmol)溶解在冷的稀盐酸(2 mol/L)溶液5 mL中,随后加入亚硝酸钠103 mg(1.49 mmol),冰水浴中搅拌反应2 h(控制反应液温度 < 5 ℃),反应结束后将反应液滴入饱和碳酸钾溶液中,再用乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥后,旋干得黄绿色固体N-环丙基-3-甲氧基-4-亚硝基苯胺。MS,m/z:192.09。
步骤三:间羟基-N,N-二乙基苯胺86 mg(0.52 mmol)溶解在i-PrOH-H2O(9∶1,4 mL)中80 ℃搅拌30 min后,将N-环丙基-3-甲氧基-4-亚硝基苯胺100 mg(0.52 mmol)和高氯酸(70%,47 μL)的i-PrOH/H2O(9∶1,4 mL)溶液缓慢加到反应中,氮气保护下80 ℃反应8 h(反应体系由棕色渐变为绿色,最后变成深蓝色),反应完全后旋干、经硅胶柱色谱纯化,得YQN-3(40 mg,收率24.9%),深蓝色固体,经质谱、核磁氢谱确证结构。MS,m/z:308.22

Figure 1 Mass spectra of YQN-3

Figure 2
化合物YQN-4的合成参考YQN-3合成,其中在步骤一中以环丁胺代替环丙胺进行反应,得到N-环丁基-3-甲氧基苯胺,后续合成方法参考YQN-3合成中的步骤二、三,最终得目标化合物YQN-4(40 mg,收率23.8%),深蓝色固体,经质谱、核磁氢谱确证结构。MS,m/z:322.21

Figure 3 Mass spectra of YQN-4

Figure 4
化合物YQN-5的合成参考YQN-3合成,其中在步骤一中以环戊胺代替环丙胺进行反应,得到N-环戊基-3-甲氧基苯胺,后续合成方法参考YQN-3合成中的步骤二、三,最终得目标化合物YQN-5(60 mg,收率34.3%),深蓝色固体,经质谱、核磁氢谱确证结构。MS,m/z:336.22

Figure 5 Mass spectra of YQN-5

Figure 6
化合物YQN-6的合成参考YQN-3合成,其中在步骤一中以环己胺代替环丙胺进行反应,得到N-环己基-3-甲氧基苯胺,后续合成方法参考YQN-3合成中的步骤二、三,最终得目标化合物YQN-6,深蓝色固体,经质谱、核磁氢谱确证结构(47 mg,收率25.8%)。MS,m/z:350.24

Figure 7 Mass spectra of YQN-6

Figure 8
通过小动物活体成像仪,探究荧光染料𫫇嗪4、YQN-3~YQN-6在正常大鼠中的坐骨神经和臂丛神经组织的靶向能力。实验过程中选取620 nm为激发波长,荧光接受信号选取670 nm波段。荧光染料𫫇嗪4、YQN-3~YQN-6采用二甲基亚砜-聚氧乙烯氢化蓖麻油-胎牛血清-PBS缓冲液(2∶1∶13∶4)的混合液溶解,按1.54 mg/kg剂量尾静脉注射给药4 h后,将脂肪和肌肉组织进行剥离,暴露出坐骨神经、臂丛神经后,再进行活体成像。
上述研究结果表明,YQN-3具有最好的神经组织靶向能力,组织背景信号最低,可进一步开发应用于手术过程中神经组织荧光成像,有效避免神经损伤而导致功能性损伤。
在大鼠甲状腺手术切除过程中,YQN-3按1.54 mg/kg剂量给药4 h后,对大鼠甲状腺附近的脂肪、肌肉组织进行剥离,暴露出甲状腺和喉返神经,在大鼠甲状腺手术切除过程中,YQN-3能有效地显示喉返神经,对其神经组织完整性进行检视,后续对荧光部位进行切除经组织病理HE染色。
CCK-8试剂法:将人脑胶质瘤细胞U8
利用生物电子等排体在荧光染料𫫇嗪4的结构基础上进行修饰得到的,即以环丙烷、环丁烷、环戊烷和环己烷对乙基进行替换得到化合物YQN-3、YQN-4、YQN-5、YQN-6。在不改变𫫇嗪母环的结构基础上进行官能团替换,旨在提高染料对神经组织的靶向能力,制备得到的YQN-3等化合物都经质谱、核磁氢谱确证结构(如
在乙腈中测定YQN-3等的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。YQN-3等的最大吸收波长在630 nm左右,如

Figure 9 Absorption spectra of fluorescent dyes YQN-3-YQN-6

Figure 10 Emission spectra of fluorescent dyes YQN-3-YQN-6
如

Figure 11 In vivo nerve imaging of oxazine 4, YQN-3, YQN-4, YQN-5 and YQN-6 (scale: 5 mm)
YQN-3具有良好的神经靶向能力,能很好地显示神经组织,可用于术中神经造影和检视。在甲状腺切除手术过程中,甲状腺切除前后,可以利用YQN-3对喉返神经进行检视,能有效避免手术过程对神经造成损伤,同时还能在术后对神经进行检视,进行有效预后。最后,将术后荧光信号部位进行切除,经病理组织HE染色分析,结果显示为神经组织。结果如

Figure 12 Imaging of YQN-3 in thyroid operationTh: Thyroid; Tr: Trachea, blue arrow indicates recurrent laryngeal nerve (scale: 200 µm)
以𫫇嗪4为阳性对照,在0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL质量浓度范围内,在低于0.2 mg/mL质量浓度的YQN-3和𫫇嗪4几乎没有细胞毒性(细胞存活率均高于75%),结果如

Figure 13 Cytotoxicity test of YQN-3 and oxazine 4 on U87 cells
本文设计并合成了4个𫫇嗪类荧光染料YQN-3 ~ YQN-6,其结构经质谱、核磁氢谱确证;YQN-3等在630 nm左右有着最大吸收,在645 nm左右有最大发射波长。进一步在臂丛神经和坐骨神经显像中,YQN-3表现出最强的神经靶向能力和最低的背景吸收,还能用于甲状腺手术切除过程中,对神经组织进行有效检视和保护,同时具有良好的安全性,具有潜在的临床神经显像应用前景。
本研究工作仍有需要进一步研究加以改善的地方:(1)YQN-3神经染料的发射波长较短,穿透深度有限。手术过程中先将神经解剖后才能有效成像,具有较大的局限性,无法契合临床需求,需提高神经染料的发射波长;(2)荧光探针的给药途径应根据探针的光学特性、成像系统的性能以及手术期间的实际情况仔细考虑。例如,在头颈部肿瘤切除过程中,需要突出显示所有神经,以避免任何神经损伤。但是,在某些情况下,如根治性前列腺切除术,不可能保留所有周围的神经组织;由于前列腺内广泛的神经荧光,全身系统性使用探针可能会降低最重要海绵体神经的信噪比。因此,在手术前需要合理评估选择最适合的给药途径来实现想要的识别和保留神经的效果。
References
Barth CW,Gibbs SL. Fluorescence image-guided surgery — a perspective on contrast agent development[J]. Proc SPIE Int Soc Opt Eng,2020,11222:112220J. [百度学术]
Wallner C,Lange MM,Bonsing BA,et al. Causes of fecal and urinary incontinence after total mesorectal excision for rectal cancer based on cadaveric surgery:a study from the cooperative clinical investigators of the Dutch total mesorectal excision trial[J]. J Clin Oncol,2008,26(27):4466-4472. [百度学术]
Merlini L,Vargas MI,Anooshiravani M,et al. Look for the nerves! MR neurography adds essential diagnostic value to routine MRI in pediatric practice:a pictorial overview[J]. J Neuroradiol,2011,38(3):141-147. [百度学术]
Kim SM,Kim SH,Seo DW,et al. Intraoperative neurophysiologic monitoring:basic principles and recent update[J]. J Korean Med Sci,2013,28(9):1261-1269. [百度学术]
Kermarrec E,Demondion X,Khalil C,et al. Ultrasound and magnetic resonance imaging of the peripheral nerves:current techniques,promising directions,and open issues[J]. Semin Musculoskelet Radiol,2010,14(5):463-472. [百度学术]
Peters TM. Image-guidance for surgical procedures[J]. Phys Med Biol,2006,51(14):R505-R540. [百度学术]
Gibbs-Strauss SL,Nasr KA,Fish KM,et al. Nerve-highlighting fluorescent contrast agents for image-guided surgery[J]. Mol Imaging,2011,10(2):91-101. [百度学术]
Wu CY,Wei JJ,Tian DH,et al. Molecular probes for imaging myelinated white matter in CNS[J]. J Med Chem,2008,51(21):6682-6688. [百度学术]
Stankoff B,Wang YM,Bottlaender M,et al. Imaging of CNS myelin by positron-emission tomography[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(24):9304-9309. [百度学术]
Wang CN,Wu CY,Zhu JQ,et al. Design,synthesis,and evaluation of coumarin-based molecular probes for imaging of myelination[J]. J Med Chem,2011,54(7):2331-2340. [百度学术]
Glasgow HL,Whitney MA,Gross LA,et al. Laminin targeting of a peripheral nerve-highlighting peptide enables degenerated nerve visualization[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2016,113(45):12774-12779. [百度学术]
Gonzales J,Demetrio de Souza Franca P,Jiang Y,et al. Fluorescence imaging of peripheral nerves by a Nav1.7-targeted inhibitor cystine knot peptide[J]. Bioconjugate Chem,2019,30(11):2879-2888. [百度学术]
Barth CW,Gibbs SL. Direct administration of nerve-specific contrast to improve nerve sparing radical prostatectomy[J]. Theranostics,2017,7(3):573-593. [百度学术]
Chan WF,Lang BHH,Lo CY. The role of intraoperative neuromonitoring of recurrent laryngeal nerve during thyroidectomy:a comparative study on 1000 nerves at risk[J]. Surgery,2006,140(6):866-872. [百度学术]
Park MH,Hyun H,Ashitate Y,et al. Prototype nerve-specific near-infrared fluorophores[J]. Theranostics,2014,4(8):823-833. [百度学术]
Osuchowski MF,Teener J,Remick D. Noninvasive model of sciatic nerve conduction in healthy and septic mice:reliability and normative data[J]. Muscle Nerve,2009,40(4):610-616. [百度学术]
Xiang ZM,Nesterov EE,Skoch J,et al. Detection of myelination using a novel histological probe[J]. J Histochem Cytochem,2005,53(12):1511-1516. [百度学术]