摘要
探讨术苓健脾胶囊（术苓）对2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠实验性结肠炎的作用及其机制。采用2.5% TNBS灌肠制备大鼠实验性结肠炎模型。将大鼠随机分为正常组、模型组、肠炎宁（180 mg/kg）组以及术苓低剂量（40 mg/kg）、高剂量（120 mg/kg）组。造模后药物治疗7 d后处死大鼠。其间每日记录大鼠体重，观察大鼠疾病活动状态。实验结束后，取结肠组织进行HE病理学分析、检测结肠组织中髓过氧化物酶（MPO）酶活、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、炎性细胞因子（IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-10）及紧密连接蛋白（occludin、ZO-1）的表达水平，并检测血清中炎性细胞因子（IL-6、IL-1β）的含量。结果表明，与模型组相比，术苓给药显著缓解了TNBS造模引起的体重下降、疾病活动指数（DAI）升高，缓解了结肠组织的缩短、水肿以及病理学损伤，减少了炎性细胞浸润、隐窝的破坏与杯状细胞的丢失，降低了结肠组织MPO酶活性、iNOS与炎性细胞因子的水平，增加了结肠紧密连接蛋白的表达，同时降低了血清中的炎性因子的含量。结果表明，术苓通过降低炎性因子水平，增加肠道紧密连接蛋白的表达，改善TNBS诱导的大鼠实验性结肠炎。本研究为术苓的临床应用提供了理论依据。
关键词
炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）影响着全球数百万人的生
中药作用温和，对IBD的治疗表现出独特的抗炎能力和疗
本研究对象术苓健脾胶囊（简称术苓）是由骨碎补、黄柏、白芍、白术、一枝黄花、乌药、党参、铁苋菜、厚朴、茯苓、泽泻、防风、薏苡仁、大黄、桂枝、陈皮、槟榔、甘草等十八味中药组成的中药制剂。该方是在宋代官修方书《太平惠民和剂局方》中的“参苓白术散”的基础上加减化裁而来，具有健脾益肾、理气、化湿、清热的功效，临床上可以用于健脾补肾，治疗腹痛、腹泻等胃肠道疾病。基于“参苓白术散”的方解以及参考术苓的现行标准——国家食品药品监督管理局标准，并综合方中各味药的用量和功效，初步将骨碎补、党参、白术、茯苓、陈皮、白芍、薏苡仁、泽泻、黄柏定为方中君臣药。方中骨碎补肾强骨，用量最大是为君药，党参、白术、茯苓益气健脾渗湿同为君药，配伍陈皮、白芍助君药以健脾益气，兼能止泻；并用薏苡仁、泽泻、黄柏助白术、茯苓健脾渗湿，均为臣药。术苓散药性平和、温而不燥，是治疗脾虚湿盛泄泻的常用方。但是术苓对于IBD的治疗作用及其分子机制仍有待进一步的研究。
目前人类已经开发多种与人类IBD症状、形态和组织病理学相似的结肠炎动物模型。其中，2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）与宿主蛋白结合后会引起机体抗原-抗体反应，导致透壁结肠炎，该模型症状、组织学改变以及T细胞免疫反应与CD更加类似，故多用于CD的研
术苓健脾胶囊（国药准字Z20140001，每粒0.27 g，金陵药业股份有限公司）；肠炎宁片（国药准字Z36020518，每片0.42 g，江西康恩贝中药有限公司）；TNBS（美国Sigma公司）；水合氯醛（上海凌峰化学试剂有限公司）；粪便隐血试剂盒（北京雷根生物技术有限公司）；TMB显色液、RIPA裂解液和BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；大鼠血清IL-6、IL-1β定量ELISA试剂盒（江苏雨桐生物科技有限公司）；RNA样品稳定剂、Pro RNA提取试剂、Evo M-MLV反转录试剂盒和SYBR Green（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；4%多聚甲醛（国药集团药业股份有限公司）；Tubulin抗体、occludin抗体与兔二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；ZO-1抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。
超纯水仪（中国力康生物医疗科技控股有限公司）；SPARK多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；7300Plus实时荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher公司）；K960 PCR热循环仪（中国力康生物医疗科技控股有限公司）；PCR基因扩增仪（中国杭州晶格科学仪器有限公司）。
50只SD大鼠适应性饲养1周，随机分为5组：对照组、模型组、肠炎宁（180 mg/kg）组、术苓低剂量（40 mg/kg）组、术苓高剂量（120 mg/kg）组，每组10只。大鼠造模前禁食不禁饮24 h，腹腔注射7%水合氯醛麻醉（300 mg/kg），液体石蜡润滑肛门管（直径2 mm）后，伸入距离大鼠肛门8 cm处，除对照组灌注生理盐水外，其余各组均缓缓推入5%TNBS与无水乙醇按2∶1体积比混合的造模剂（150 mg/kg）。大鼠倒置10 min后转移鼠笼内，等待其自然苏醒。造模当天根据分组灌胃不同剂量的药物治疗，治疗与造模同步，持续7 d。
每日观察动物疾病活动状态，称量体重，观察粪便性状及便血情况，粪便隐血试剂盒检测有无隐血。参照文献［
取动物结肠组织，采用4%多聚甲醛固定24 h，随后进行石蜡包埋、切片及苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，使用倒置显微镜观察拍照后。参照文献［
取结肠组织称重，每10 mg组织加入生理盐水100 μL，在冰中用电动组织研磨器研磨得到结肠组织匀浆，12 000 r/min 离心10 min（4 ℃）后得结肠匀浆上清液。取结肠匀浆上清液10 μL，加入96孔板中，按照TMB显色液说明书指示，加TMB显色液50 μL，空白对照孔中不加样品，其余步骤相同。在室温下反应5 min。再加入浓硫酸终止液50 μL终止反应。使用酶标仪测450 nm处的吸收度，MPO相对酶活（U/g） = （样品孔测定吸收度 - 空白对照孔吸收度）/取样量（g）。随后进行统计学分析。
取小段结肠组织（于RNA样品稳定剂中保存），根据RNA提取试剂盒进行操作提取组织RNA，酶标仪检测RNA浓度，采用逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，RT-qPCR检测结肠组织中的炎性因子IL-6、IL-1β、IL-10、IFN-γ、iNOS的RNA表达水平变化。实时荧光定量PCR仪调节参数：94 ℃ → 3 min；94 ℃ → 5 s；退火温度60 ℃ → 30 s（40个循环）。实验结果按照
| Gene | Primer sequences (5′→3′) | |
|---|---|---|
| GAPDH | Forward | CAAGTTCAACGGCACAGTCAAG |
| Reverse | ACATACTCAGCACCAGCATCAC | |
| IL-6 | Forward | TCTGCTCTGGTCTTCTGGAGT |
| Reverse | GCATTGGAAGTTGGGGTAGGA | |
| IL-1β | Forward | CCTATGTCTTGCCCGTGGAG |
| Reverse | TCCTGGGGAAGGCATTAGGA | |
| IL-10 | Forward | AATTGAACCACCCGGCATCT |
| Reverse | TTTCCAAGGAGTTGCTCCCG | |
| IFN-γ | Forward | CATCGCCAAGTTCGAGGTGA |
| Reverse | CACCGACTCCTTTTCCGCTT | |
| iNOS | Forward | TGCTTCTGTGCTAATGCGGA |
| Reverse | CGCTTCCGACTTTCCTGTCT | |
取适量结肠组织，加入预冷的RIPA裂解液，在冰中用高速低温组织研磨仪充分研磨后，冰上裂解30 min，12 000 r/min，4 ℃，离心10 min，吸取上清液，按照BCA蛋白定量试剂盒的说明操作检测蛋白含量。使用12% SDS-PAGE进行蛋白质的分离，随后转移到PVDF膜上。转膜后使用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗（ZO-1，1∶1 000；occludin，1∶1 000；Tublin，1∶2 000）4 ℃孵育过夜，HRP标记的二抗室温孵育1 h，加入适量ECL曝光液曝光。使用Image J进行灰度分析。
血清于5 000 r/min，4 ℃，离心5 min后收集上清液。根据ELISA试剂盒说明书测定IL-6、IL-1β。简言之，将待测样品加入样品孔，在37 ℃培养箱中孵育20 min，洗涤液洗涤5次，每孔加入酶标抗体，37 ℃孵育30 min，洗涤液洗涤，重复5次，拍干；在样品孔中加入显色剂A、B，盖上覆膜，轻轻振荡混匀，37 ℃避光孵育10 min；加入终止液，终止反应，立即用酶标仪测定450 nm处的吸收度。根据标准品浓度对应吸收度制作标准曲线，并根据样品吸收度计算样品相应浓度。
与对照组相比，模型组大鼠体重显著下降（P < 0.05），并出现精神萎靡、毛色暗淡、倦怠懒动等症状，而术苓与肠炎宁给药治疗以后，体重变化率呈现出了上升的趋势，其中术苓高剂量组体重显著增加（P < 0.05，
Figure 1 Effect of Zhuling Jianpi capsule （ZL） on disease characterization of colitis rats ()
A: Body weight change; B: Survival rate; C: Disease activity index (DAI). CYN:Changyanning tablet
大鼠结肠照片如
Figure 2 Effects of Zhuling Jianpi capsule on the morphologic changes of colon in colitis rats ()
A: Colon image; B: Colon length; C:Relative colon index
结肠HE染色结果如
Figure 3 Representative HE staining of colon tissue in colitis rats (200 × ) and histological score ()
###P < 0.001 vs control group;
MPO是来源于中性粒细胞的蛋白质，其酶活性反映中性粒细胞浸润能力。由
Figure 4 Effect of Zhuling Jianpi capsule on inflammatory cytokines in the colon of colitis rats ()
A: Colonic MPO enzyme activity; B-F: Gene expression of IL-1β,IL-6,IFN-γ,IL-10 and iNOS in colonic tissue examined by quantitative RT-qPCR
Occludin、ZO-1均为结肠上皮屏障的紧密连接蛋白。与对照组相比，模型组的occludin、ZO-1的蛋白表达显著下降（P < 0.05，
Figure 5 Effects of Zhuling Jianpi capsule on intestinal tight junction protein expression of colitis rats ()
A: Western blot of the expression of colonic occludin and ZO-1 protein; B: Quantification of the expression of ZO-1; C: Quantification of the expression of occludin
血清中炎性因子的含量是反映机体炎症状态的重要指标。通过ELISA检测发现，与对照组相比，模型组血清中IL-6、IL-1β水平显著增加（P < 0.05），而经术苓与肠炎宁治疗后，二者浓度均显著下降（P < 0.05，
Figure 6 Effects of Zhuling Jianpi capsule on serum inflammatory factors IL-6 (A) and IL-1β (B) in colitis rats ()
##P < 0.01,
术苓由十八味中药组成。该复方中包含了多种抗炎药物。其中骨碎补在体内代谢的化学成分主要有黄酮类、三萜类、苯丙素类和木脂素类，具有保肾、消炎、降低血脂等作
本实验使用TNBS构建大鼠结肠炎实验模型，结果表明，模型组大鼠表现出严重的体重下降、腹泻伴随便血、死亡率增加等现象，而术苓给药治疗后大鼠以上症状得到缓解，初步证明了术苓对于TNBS诱导的大鼠结肠炎的治疗作用。结肠长度缩短以及黏膜充血性水肿是IBD的重要特
MPO主要存在于中性粒细胞中。结肠组织中MPO的水平间接反映了肠组织中中性粒细胞浸润的程
综上所述，术苓能显著改善TNBS构建的结肠炎大鼠的肠道炎症水平及肠上皮屏障功能。但是术苓的化学成分繁多，且化合物之间的协同作用对药效影响甚大，需要进一步探究其药效物质基础，阐明可能发挥作用的活性成分以进一步指导临床用药。
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