使用Chrome浏览器效果最佳,继续浏览,你可能不会看到最佳的展示效果,

确定继续浏览么?

复制成功,请在其他浏览器进行阅读

COVID-19鼻腔黏膜免疫疫苗的研究进展

  • 吴雅琦 1,2
  • 李蒙 2
  • 邢昊楠 2
  • 陈大全 1
  • 郑爱萍 2
1. 烟台大学药学院,烟台 264005; 2. 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,北京 100850

中图分类号: S852.4

最近更新:2023-01-20

DOI:10.11665/j.issn.1000-5048.20220602

  • 全文
  • 图表
  • 参考文献
  • 作者
  • 出版信息
EN
目录contents

摘要

呼吸道黏膜免疫系统是机体抵御感染的第一道防线,自2019年新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)发生以来,鼻腔黏膜免疫疫苗因具有诱导细胞、体液及黏膜三重免疫应答能力,已成为研究的热点。本文聚焦于新型冠状病毒,了解其结构及致病机制,并对鼻腔黏膜免疫机制进行简要介绍,概述鼻腔黏膜免疫疫苗种类及临床研究进展,以期为新型疫苗的研发提供理论参考,寻求预防治疗COVID-19的最佳方法与策略。

2019年,由高传播性和致病致死性的新型冠状病毒严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的COVID-19疫情迅速蔓延全球,给人类的生命健康安全带来巨大威胁。截至目前,控制疫情和预防死亡的最佳策略仍然是接种疫苗,设计具有预防和治疗作用的新型疫苗迫在眉睫。

疫苗主要给药途径为肌肉注射、皮下注射或皮内注射,但注射人员须经专门培训,且注射有产生疼痛和急性感染的风险,患者依从性差,同时在应对SARS-CoV-2等呼吸道病毒时不足以防止病毒传播。因此,探索疫苗递送的非侵入性给药途径具有必要性。黏膜免疫由于其独特的优势成为疫苗研究的热点,其中鼻腔免疫接种作为全身疫苗接种的替代方法,与注射给药相比,更为安全有效,可有效诱导免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA),激发鼻腔和上呼吸道中的常驻记忆B和T细胞,进而产生细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫三重免疫应答,阻止病毒的复制与传

1-2。本文概述SARS-CoV-2的结构特征及鼻腔黏膜的免疫机制,并进一步阐述COVID-19鼻腔黏膜免疫疫苗的种类及研究进展,为新型抗新冠疫苗研发奠定基础或提供依据。

1 SARS-CoV-2的结构特征

SARS-CoV-2是一种单链正链RNA(+ssRNA)病毒,具有单一线性RNA片段,属于冠状病毒家族。如图1所示,SARS-CoV-2主要由4种结构蛋白组成:刺突蛋白(spike protein,S)、包膜蛋白(envelope protein,E)、膜蛋白(membrane protein,M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)。N蛋白包围病毒RNA,参与病毒的复制及释放;S、E和M蛋白形成病毒包膜,其中M蛋白是最大的结构蛋白,E蛋白对于病毒复制和成熟必不可少,而S蛋白则与病毒的传染能力密切相关,在病毒进入宿主细胞的过程中发挥关键作

3-4

  

Figure 1  Structure of SARS-CoV-2 virus

SARS-CoV-2冠状病毒进入宿主细胞由S蛋白介导。S蛋白在病毒表面形成同型三聚体,负责病毒与宿主细胞膜的附着和融合。S蛋白包含S1和S2两个结构域,其中S1结构域含有的受体结合域(receptor binding domain,RBD)负责与细胞表面受体血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合,S2结构域负责病毒膜和细胞膜融合,从而允许病毒进入细胞(图2)。因此,SARS-CoV-2的S蛋白及其受体结合域RBD是病毒中和抗体的关键靶

5-7

  

Figure 2  Mechanism of SARS-CoV-2 entering human cellsACE2: Angiotensin-converting enzyme 2

2 鼻腔黏膜免疫机制

新冠病毒的主要传播途径是呼吸道传播和接触传播。接触传播主要来源于感染者释放的病毒颗粒/飞沫沉降到物体表面,健康者手接触后沾染病毒,在不经意间触碰到鼻腔、口腔或者眼睛结膜等黏膜时,病毒就容易入侵人体,导致感染;呼吸道传播是病毒携带者通过打喷嚏、咳嗽或交谈,以飞沫或气溶胶的形式在空气中释放病毒微粒,以空气为介质进行传播,将病毒传染给健康者。研究证明,鼻上皮中ACE2的浓度最高,可以推断病毒颗粒的复制主要发生在鼻腔黏

8-10,因此,需进一步了解鼻腔黏膜免疫机制,可为鼻腔黏膜免疫疫苗的开发提供理论依据。

黏膜相关淋巴组织(mucosal-associated lymphoid tissue,MALT)亦称黏膜免疫系统(mucosal immune system,MIS),是指广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺体处的淋巴组织,是执行局部特异性免疫功能的主要场所。大部分病毒和细菌感染始于黏膜表面,MALT构成了机体的第一道防线。黏膜表面与外界抗原直接接触,在外来病原微生物或其他外来抗原侵入机体组织之前将其消灭,使其无法损伤机体,在抵抗感染方面发挥极其重要的作

11-12。其中,鼻相关淋巴组织 (nose-associated lymphoid tissue,NALT)是由鼻腔至咽道黏膜的淋巴样组织构成,在人体中被描述为一个组织环(Waldeyer环),主要包括鼻咽腺样体(或扁桃体)、咽鼓管扁桃体、腭扁桃体及舌扁桃体。

NALT是上呼吸道主要的免疫防御屏障,是鼻腔接种疫苗后黏膜免疫反应的主要诱导部位,鼻腔接种疫苗后NALT的免疫反应机制见图3。NALT由树突状细胞(dendritic cell,DC)、T细胞和B细胞等参与诱导免疫反应的抗原呈递细胞构成,这些细胞被一层特殊的上皮细胞所覆盖,称为M细胞。M细胞位于黏膜组织中的滤泡相关上皮上,主要吸收颗粒抗原,并通过上皮屏障将抗原运送到底层淋巴细胞来诱导黏膜免

13-14。NALT摄取抗原的方式主要通过上皮直接摄取或由M细胞主动转运,抗原被摄取后,未成熟DC离开黏膜组织进入引流淋巴结,分化为成熟DC,对抗原进行处理和呈递,抗原特异性CD4+ T细胞被激活,激活的T细胞与B细胞相互作用,B细胞发展为IgA+ B细胞,随后移动到效应部位(如鼻腔中),在那里IgA+ B细胞分化为浆细胞,浆细胞以二聚体形式分泌IgA,然后,二聚体IgA通过与聚合物Ig受体结合成为分泌型IgA(secretory Immunoglobulin A,SIgA),最后,聚合物Ig受体将IgA转运至效应位15-17

  

Figure 3  Mechanism of NALT immune response after nasal vaccination[

18]

NALT能够同时产生细胞、体液和黏膜三重免疫应答,而其他黏膜组织(如,口腔黏膜和阴道黏膜)并不具有这一特性。由于鼻黏膜给药独特的免疫优势,使得鼻腔免疫疫苗成为当前研究的热点。细胞免疫反应通过抗体依赖细胞介导的细胞毒反应和直接细胞毒性T 细胞来实现,能够直接杀死特殊的感染细胞,因而对细菌、病毒和寄生虫等的清除至关重要。黏膜部位的体液免疫反应通过使活化的B 细胞分泌二聚体或多聚体形式的IgA来实现,能够抵抗酶的降解,发挥黏膜免疫作用。SIgA是抵御病原体入侵的第一道屏障,它可以结合并中和黏液中的病原体或毒素,阻止病毒与黏膜表面直接接触,进而将病毒清除。因此诱导有效的IgA应答是黏膜免疫疫苗成功接种的先决条件,是实现黏膜免疫的关

19

3 COVID-19鼻腔黏膜免疫疫苗种类

研究表明,鼻纤毛细胞是SARS-CoV-2最初的感染和复制部位,SARS-CoV-2一旦到达肺部,会导致严重肺炎并伴有其他疾病的发

20。因此在病毒感染的初始位置杀死病毒至关重要,鼻腔给药途径已被证明能预防SARS-CoV-2病毒感染并提供优越的局部黏膜免疫诱21-22。自COVID-19疫情爆发以来,开发安全有效、易于接种的非侵入性鼻腔疫苗迫在眉睫,以多条技术路线的成百上千个疫苗研发项目在全球应急启动,其中针对SARS-CoV-2的鼻腔黏膜免疫疫苗的开发主要集中在核酸疫苗(DNA和RNA疫苗)、病毒载体疫苗及亚单位疫苗。

3.1 核酸疫苗

3.1.1 DNA疫苗

DNA疫苗的原理是通过一定的途径使编码免疫原性抗原的重组质粒载体进入人体内表达抗原,诱导人体产生免疫应答。因与传统疫苗相比,DNA疫苗具有研发和生产周期短、稳定性高,能诱导更强大的细胞毒性T细胞反应,且没有严重的不良反应等优

23-26,DNA疫苗成为疫情大流行爆发时的理想疫苗候选者。印度开发的COVID-19 DNA疫苗(ZyCoV-D)是第一个被批准用于人类的DNA疫苗,临床数据显示该疫苗在预防症状性感染方面的有效率为67%,在预防中度疾病方面的有效率为100%,由此可证明DNA疫苗有望有效控制大流27-28

DNA疫苗是一种针对特定蛋白的抗体疫苗,已被证明擅长触发细胞免疫反应,且更快速、更容易放大生产,因此鼻腔黏膜免疫DNA疫苗的开发显示出较好的应用前景。研究人员采用基因转移技术开发了一种新型鼻腔喷雾COVID-19疫苗,该疫苗以腺病毒为载体递送克隆的DNA链,能使鼻咽细胞产生病毒蛋白,进而对疫苗产生反应,并且在动物研究中表现良好,人体临床试验也将逐步开展,有望获得上市授

29。研究表明,不带电荷的颗粒容易聚集且不稳定,原因可能是DNA的超螺旋结构和负电荷会阻碍或降低疫苗的包埋效率和稳定性,因此研究人员使用阳离子成分,如壳聚糖以纳米颗粒或微粒的形式与DNA抗原复合用于鼻腔给药,含有壳聚糖的纳米颗粒可以稳定包载DNA,此外壳聚糖还可以作为免疫增强剂来增强疫苗的免疫原性和效30-32。Kumar33开发并评价了一种金纳米星形壳聚糖(AuNS-几丁聚糖) 纳米制剂。该制剂采用壳聚糖包覆星形的金纳米颗粒用于鼻腔给药递送表达SARS-CoV-2 S蛋白的DNA,可在小鼠呼吸道黏膜和肺组织中成功表达SARS-CoV-2 S蛋白抗原,产生广泛的免疫反应,包括鼻腔和呼吸道的局部免疫 (黏膜IgA) 以及全身免疫(中和IgG)。此外,这种鼻腔疫苗接种策略还在肺黏膜和组织驻留记忆T细胞(tissue-resident memory T,TRM) 中表现出显著的抗SARS-CoV-2 IgA水平,从而有效地中和了SARS-CoV-2不同突变体(武汉株、D614G株和β突变体)的伪病毒,提供了持久免疫。

3.1.2 RNA疫苗

RNA疫苗因其只需进入细胞质而不需进入细胞核内即能发挥作用,所以安全性相对较高,这也促使RNA疫苗成为当前新型核酸疫苗研究的热

34。但大部分RNA疫苗多采用肌肉注射途径,如获批紧急使用授权的mRNA疫苗BNT162b2(一种编码SARS-CoV-2 S蛋白的脂质纳米粒mRNA疫苗35。Tang36以小鼠为免疫模型进行研究,发现单独进行全身mRNA疫苗接种仅能诱导弱的呼吸道黏膜中和抗体反应,而全身mRNA疫苗接种与鼻腔黏膜免疫相结合则诱导了强烈的中和抗体反应。研究表明,黏膜接种加强mRNA疫苗的方式,能在呼吸道建立强大免疫力,对抗SARS-CoV-2以及Omicron亚系等变体的感染。采用鼻腔免疫RNA疫苗的研究也正在逐步开发中。Amyris公司与美国传染病研究所(Infectious Disease Research Institute,IDRI)合作研发的鼻腔给药Amyris/IDRI RNA新冠疫苗展现出鼻内递送潜37。该疫苗基于角鲨烯可以增强人体对疫苗活性成分的免疫反应这一特性,以含有角鲨烯的脂质纳米颗粒为载体,将附着在载体表面的 RNA 送到细胞中。其体内结果表明,Amyris/IDRI RNA递送至鼻黏膜可产生抗体,对上呼吸道形成保护,有助于更加全面地防御 COVID-19。未来有望研发出更多针对COVID-19的RNA鼻腔疫苗,并且疫苗研发的鼻黏膜递送技术也可用于其他呼吸道感染疾病。

3.2 病毒载体疫苗

病毒载体疫苗,即使用经过修改的无害的病毒为载体将抗原(如SARS-CoV-2 S蛋白)的遗传密码(DNA或RNA)传递到人体细胞,模拟自然病毒感染,以产生所需的免疫反

38

研究人员利用复制能力不强、无致病性的人副流感病毒2型 (human parainfluenza virus2,HPIV2)载体BC-PIV研制SARS-CoV-2鼻腔疫苗。研究表明,表达前预融合稳定S蛋白的BC-PIV在小鼠鼻内接种疫苗后可诱导产生抗SARS-CoV-2 的血清中和IgG和鼻黏膜IgA抗体,从而预防呼吸道的病毒感染,且无明显的不良反

39-40。一种基于新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)表达SARS-CoV-2S蛋白的重组NDV-S载体疫苗,经小鼠鼻内接种后可诱导高水平的SARS-CoV-2特异性中和IgA、IgG2a抗体及T细胞免疫,接种两剂鼻内NDV-S疫苗能显著减少病毒扩散,对机体起到保护作41。此外,以腺病毒为载体的疫苗也被用于控制感染和阻止病毒传播。Qin42开发了一种表达SARS-CoV-2 S蛋白RBD的9型腺相关病毒载体疫苗(adeno-associated virus 9-RBD,AAV9-RBD)。该疫苗的设计原理是将一个信号肽插入两个RBD拷贝的N端并通过连接子插入9型腺相关病毒的基因组中。体外实验结果显示,AAV9-RBD能使HeLa细胞表达高水平的重组RBD蛋白,对BALB/c小鼠进行滴鼻免疫后8周,小鼠血清中可检测到中和抗体,表明AAV9-RBD疫苗有望用于SARS-CoV-2鼻腔疫苗的开发。

3.3 亚单位疫苗

基因重组亚单位疫苗仅包含源自致病性细菌或病毒的某些成分,这些成分是能够引起机体免疫反应的主要物质,由于其不含完整病原体,因此安全性好,在临床研究中显示出较好的潜力。

干扰素基因刺激物 (stimulator of interferon genes,STING)能够感知胞浆核酸,并激活TANK结合激酶-1(TANK binding kinase 1,TBK1)/干扰素调节因子-3(interferon regulatory factor 3,IRF-3)信号通路,诱导促炎细胞因子和干扰素-β(interferon-β,IFN-β)的表

43。研究人员报道了一种针对SARS-CoV-2的鼻腔亚单位疫苗的研44。该疫苗使用冷冻干燥的S蛋白并以脂质体STING激动剂(STING agonist,STINGa)为佐剂。STINGa是一种新型免疫刺激佐剂,可用于小鼠呼吸道病原体(包括流感和炭疽病)黏膜疫苗。将该疫苗鼻腔免疫小鼠后,结果显示此疫苗安全有效,可诱导小鼠全身中和抗体及肺内T细胞反应,产生肺和鼻腔内IgA,诱导对SARS-CoV-2的全面免疫。研究证实,在鼻腔接种时,NALT作为诱导位点发挥作用,导致生发中心B细胞和T细胞的激活与分化,此外鼻腔接种还在肺部和脾脏局部诱导了特异性T细胞反应,进一步说明了鼻腔免疫的优势。此外,Du45制备了一种基于SARS-CoV-2 RBD的重组亚单位疫苗,通过鼻腔接种、微针皮内注射和肌肉注射免疫小鼠,比较小鼠RBD特异性免疫应答。结果表明,鼻腔免疫接种方式可诱导较强的体液免疫,产生高滴度的IgG抗体,具有较强的中和活性、平衡的Th1/Th2应答以及显著的黏膜免疫力。因此,鼻腔免疫亚单位疫苗有望用于缓解当前SARS-CoV-2大流行的状况。

4 COVID-19鼻腔黏膜免疫疫苗的临床研究

如前所述,自SARS-CoV-2基因组序列发布以来,针对COVID-19的一系列疫苗平台被开发利用,多种候选疫苗处于临床评估阶段,主要以SARS-CoV-2 S蛋白及RBD为靶

46-47,截至2022年12月15日,COVID-19鼻腔黏膜免疫疫苗不同阶段的临床试验见表1。其中进入Ⅰ期临床试验的COVID-19鼻腔疫苗占据绝大部分,COVID-19鼻腔黏膜免疫疫苗从开发到临床应用的道路仍任重道远。

Table 1  Clinical trials of a nasal mucosal immunization vaccine against COVID-19
PhaseVaccineTypeDeveloper/manufacturerEnrollmentClinical trial No.Status
I Ad5-nCoV Ad-vectored vaccine CanSino/Beijng Institute of Biotechnology 149 NCT04552366 Active,not recruiting
ChAdOx1nCOV-19 Ad-vectored vaccine University of Oxford 42 NCT04816019 Complete
BBV154 Ad-vectored vaccine Bharat Biotech Intemational Limited 175 NCT04751682 Complete
SC-Ad6-1 . Ad-vectored vaccine Tetherex Pharmaceuticals Corporation 130 NCT04839042 Recruiting
AdCOVID Ad-vectored vaccine Altimmune, Inc. 92 NCT04679909 Active,not recruiting
NDV-HXP-S NDV-vectored vaccine Sean Liu,Icahn School of Medicine at Mount Sinai 35 NCT05181709 Recruiting
AVX/COVID-12-HEXAPRO NDV-vectored vaccine LaboratorioAvi-Mex. SA de CV. 91 NCT04871737 Complete
DelNS1-nCoV-RBD LAIV LAIV-vectored vaccine The University of Hong Kong 115 NCT04809389 Active,not recruiting
DelNS1-2019-nCoV-RBD-OPT1 LAIV-vectored vaccine University of Hong Kong. Xia men University and Being Wantai Biological Pharmacy 60 ChiCTR000037782 Complete
CVXGA1 PIV5-vectored vaccine CyanVac LLC 80 NCT04954287 Recruiting
MV-014- 212 RSV-vectored vaccine Meissa Vaccines,Inc. 130 NCT04798001 Recruiting
Razi CoV Pars Protein subunit vaccine Razi Vaccine and Serum Research Institute 153 IRCT20201214049709N1 Complete
Gam-COVID-Vac two-component combined Ad-vector vaccine Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology,Health Ministry of the Russian Federation 400 NCT05248373 Not yet recruiting
COVI-VAC Live attenuated vaccine Codagenix. Inc. 48 NCT04619628 Complete
GLS-5310 DNA vaccine GeneOne Life Science,Inc. 69 NCT05182567 Active,not recruiting
Avacc 10 OMV vaccine Intravacc B.V. 36 NCT05604690 Not yet recruiting
II BBV154 Ad-vectored vaccine Bharat Biotech Intemational Limited 608 NCT05639998 Complete
AVX/COVID-12 NDV-vectored vaccine LaboratorioAvi-Mex. SA de CV. 158 NCT05205746 Active,not recruiting
Razi CoV Pars Protein subunit vaccine Razi Vaccine and Serum Research Institute 500 IRCT20201214049709N2 Complete
DelNS1-2019-nCoV-RBD-OPT1 LAIV-vectored vaccine University of Hong Kong. Xia men University and Being Wantai Biological Pharmacy 720 ChiCTR2000039715 Complete
III BBV154 Ad-vectored vaccine Bharat Biotech Intemational Limited 3 160 NCT05522335 Active,not recruiting
Razi CoV Pars Protein subunit vaccine Razi Vaccine and Serum Research Institute 41 128 IRC720210206050259N3 Complete
DelNS1-2019-nCoV-RBD-OPT1 Influenza Virus Vector N/A 20 000 ChiCTR2100051391 Complete

Ad: Adenovirus; NDV: Newcastle disease virus; LAIV: live attenuated influenza virus; PIV: parainfluenza virus; RSV: respiratory syncytial virus; OMV: outermembrane vesicles; N/A: Not available. Data from https://clinicaltrials.gov/,https://covid-19.cochrane.org/andhttps://trialsearch.who.int/Default.aspx

COVID-19鼻腔疫苗主要以病毒载体疫苗开发为主,我国康希诺生物研发团队研发了全球首款可吸入用新冠疫苗克威®。该疫苗以5型腺病毒为载体实现机体的免疫记忆功能,可高效激发黏膜、体液和细胞三重免疫保护,目前已在上海等地推广使

48。此前在国际权威医学期刊《柳叶刀》发表的Ⅲ期临床研究数据显示,接种1剂克威®14 d后,总体保护率为63.7%,重症保护率为96.0%,28 d后,总体保护率为57.5%,重症保护率为91.7%。全球多中心Ⅲ期临床试验的结果达到世界卫生组织建议的保护率标准,严重不良事件发生率低,该临床试验同时证明了克威®在60岁以上老年人的安全49。2022年12月5日,万泰生物发布公告,其与厦门大学、香港大学合作研发的鼻喷新冠疫苗获国家药监局同意紧急使用,该疫苗采用流感病毒作为载体并经鼻喷给药,是全球迄今唯一在Ⅲ期临床试验中验证了安全性和广谱有效性的黏膜免疫新冠疫苗。2022年10月完成Ⅲ期临床试验,数据表明,不论用于无免疫史人群的基础免疫还是有免疫史人群的序贯加强免疫,鼻喷新冠疫苗对于Omicron突变株感染导致的COVID-19均可产生良好的保护效力,同时具有很好的安全性,在疫情持续高发和防疫措施转向的当下,进一步通过异源加强免疫有利于形成更全面的保50

5 总结与展望

当前全世界范围内COVID-19疫情仍在肆虐,接种疫苗是防止疫情迅速大范围传播最有效的方法。免疫途径的选择对于诱导有效免疫保护至关重要,黏膜表面是病原体进入并感染机体的主要部位。SARS-CoV-2病毒变异快,感染路径由上呼吸道传播转为下呼吸道传播,甚至会同时攻击上呼吸道和下呼吸道,因此建立呼吸道黏膜免疫屏障是对抗COVID-19的有效策略。鼻腔黏膜免疫疫苗作为一种新型非侵入式疫苗给药系统,具有使用方便、安全有效、患者顺应性好等特点,并能提高免疫治疗效果,诱导细胞、体液和黏膜免疫应答,实现三重免疫,在新冠免疫疫苗的未来发展方向上,鼻腔疫苗接种或将成为预防COVID-19等呼吸道传染病的有效途径。

与此同时,鼻腔黏膜免疫仍存在一些问题有待改进,如抗原的稳定性、有效摄取及免疫佐剂的安全性,同时由于SARS-CoV-2 病毒变异快,不断出现逃逸株,难以形成针对变异株的群体免疫,迫切需要研发新型抗新冠疫苗。采用广谱的免疫原设计高度活化中和抗体,与T细胞应答协同抗击病毒并有效清除病毒,构建群体有效免疫保护;采用鼻腔黏膜接种或黏膜与肌肉序贯接种,以实现黏膜持久应答,加强免疫反应,持续防御病毒,防止病毒持续变异。随着对鼻腔黏膜免疫机制及COVID-19鼻腔黏膜免疫疫苗研究的深入,将使鼻腔黏膜免疫在COVID-19疫情中发挥更强有力的作用,对传染病的防控具有重要意义。

References

1

Adashi EYGruppuso PA. Intranasal SARS-CoV-2 vaccines:indispensable and inevitable[J]. Am J Prev Med2022636):1062-1063. [百度学术] 

2

Primorac DVrdoljak KBrlek Pet al. Adaptive immune responses and immunity to SARS-CoV-2[J]. Front Immunol202213848582. [百度学术] 

3

Tang XLWu CCLi Xet al. On the origin and continuing evolution of SARS-CoV-2[J]. Natl Sci Rev202076):1012-1023. [百度学术] 

4

Kang SSYang MHong ZSet al. Crystal structure of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein RNA binding domain reveals potential unique drug targeting sites[J]. Acta Pharm Sin B2020107):1228-1238. [百度学术] 

5

Letko MMarzi AMunster V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses[J]. Nat Microbiol202054):562-569. [百度学术] 

6

Wu CRLiu YYang YYet al. Analysis of therapeutic targets for SARS-CoV-2 and discovery of potential drugs by computational methods[J]. Acta Pharm Sin B2020105):766-788. [百度学术] 

7

Jackson CBFarzan MChen Bet al. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells[J].Nat Rev Mol Cell Biol2022231):3-20. [百度学术] 

8

HouYJOkuda KEdwards CEet al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract[J]. Cell20201822):429-446.e14. [百度学术] 

9

Takabayashi TYoshida KImoto Yet al. Regulation of the expression of SARS-CoV-2 receptor angiotensin-converting enzyme 2 in nasal mucosa[J]. Am J Rhinol Allergy2022361):115-122. [百度学术] 

10

Nocini RHenry BMMattiuzzi Cet al. Improving nasal protection for preventing SARS-CoV-2 infection[J]. Biomedicines20221011):2966. [百度学术] 

11

McGhee JRMestecky JDertzbaugh MTet al. The mucosal immune system:from fundamental concepts to vaccine development[J]. Vaccine1992102):75-88. [百度学术] 

12

Ryan EJDaly LMMills KH. Immunomodulators and delivery systems for vaccination by mucosal routes[J]. Trends Biotechnol2001198):293-304. [百度学术] 

13

Davis SS. Nasal vaccines[J]. Adv Drug Deliv Rev2001511/2/3):21-42. [百度学术] 

14

Woodrow KABennett KMLo DD. Mucosal vaccine design and delivery[J]. Annu Rev Biomed Eng20121417-46. [百度学术] 

15

Focosi DMaggi FCasadevall A. Mucosal vaccines,sterilizing immunity,and the future of SARS-CoV-2 virulence[J]. Viruses2022142):187. [百度学术] 

16

Zaman MChandrudu SToth I. Strategies for intranasal delivery of vaccines[J]. Drug Deliv Transl Res201331):100-109. [百度学术] 

17

Bernasconi VNorling KBally Met al. Mucosal vaccine development based on liposome technology[J]. J Immunol Res201620165482087. [百度学术] 

18

Tiboni MCasettari LIllum L. Nasal vaccination against SARS-CoV-2:synergistic or alternative to intramuscular vaccines[J]? Int J Pharm2021603120686. [百度学术] 

19

Zainutdinov SSSivolobova GFLoktev VBet al. Mucosal immunity and vaccines against viral infections[J]. VoprVirusol2022666):399-408. [百度学术] 

20

Cyranoski D. Profile of a killer:the complex biology powering the coronavirus pandemic[J]. Nature20205817806):22-26. [百度学术] 

21

Ahn JHKim JHong SPet al. Nasal ciliated cells are primary targets for SARS-CoV-2 replication in the early stage of COVID-19[J]. J Clin Invest202113113):e148517. [百度学术] 

22

Hassan AOKafai NMDmitriev IPet al. A single-dose intranasal ChAdvaccine protects upper and lower respiratory tracts against SARS-CoV-2[J]. Cell20201831):169-184.e13. [百度学术] 

23

Tang JCai LXu CFet al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa[J]. Nanomaterials (Basel)2022122):226. [百度学术] 

24

Ingolotti MKawalekar OShedlock DJet al. DNA vaccines for targeting bacterial infections[J]. Expert Rev Vaccines201097):747-763. [百度学术] 

25

Xu YYYuen PWLam JKW. Intranasal DNA vaccine for protection against respiratory infectious diseases:the delivery perspectives[J]. Pharmaceutics201463):378-415. [百度学术] 

26

Mallapaty SCallaway E. What scientists do and don't know about the Oxford-AstraZeneca COVID vaccine[J]. Nature20215927852):15-17. [百度学术] 

27

Sheridan C. First COVID-19 DNA vaccine approved,others in hot pursuit[J]. Nat Biotechnol20213912):1479-1482. [百度学术] 

28

Mallapaty S. India's DNA COVID vaccine is a world first - more are coming[J]. Nature20215977875):161-162. [百度学术] 

29

University of Eastern Finland.University of Eastern Finland scientists are developing nasal vaccine against COVID-19[EB/OL].(2020-04-15)[2020-04-21].https://sciencebusiness.net/network-updates/university-eastern-finland-scientists-are-developing-nasal-vaccine-against-covid-19. [百度学术] 

30

Boroumand HBadie FMazaheri Set al. Chitosan-based nanoparticles against viral infections[J]. Front Cell Infect Microbiol202111643953. [百度学术] 

31

Mura PMaestrelli FCirri Met al. Multiple roles of chitosan in mucosal drug delivery:an updated review[J]. Mar Drugs2022205):335. [百度学术] 

32

Gong XGao YShu Jet al. Chitosan-based nanomaterial as immune adjuvant and delivery carrier for vaccines[J]. Vaccines (Basel)20221011):1906. [百度学术] 

33

Kumar USAfjei RFerrara Ket al. Gold-nanostar-chitosan-mediated delivery of SARS-CoV-2 DNA vaccine for respiratory mucosal immunization:development and proof-of-principle[J]. ACS Nano20211511):17582-17601. [百度学术] 

34

Brito LAKommareddy SMaione Det al. Self-amplifying mRNA vaccines[J]. Adv Genet201589179-233. [百度学术] 

35

Vogel ABKanevsky IChe Yet al. A prefusion SARS-CoV-2 spike RNA vaccine is highly immunogenic and prevents lung infection in non-human primates[J]. bioRxiv2020.DOI:10.1101/2020.09.08.280818. [百度学术] 

36

Tang JYZeng CCox TMet al. Respiratory mucosal immunity against SARS-CoV-2 after mRNA vaccination[J]. Sci Immunol2022776):eadd4853. [百度学术] 

37

AmyrisInc.Amyris achieves promising in-vivo results for intranasal delivery of RNA/NLC Vaccine[EB/OL].[2021-08-20].https://www.prnewswire.com/news-releases/amyris-achieves-promising-in-vivo-results-for-intranasal-delivery-of-rnanlc-vaccine-301359641.html. [百度学术] 

38

Rollier CSReyes-Sandoval ACottingham MGet al. Viral vectors as vaccine platforms:deployment in sight[J]. Curr Opin Immunol2011233):377-382. [百度学术] 

39

Ohtsuka JFukumura MFuruyama Wet al. A versatile platform technology for recombinant vaccines using non-propagative human parainfluenza virus type 2 vector[J]. Sci Rep201991):12901. [百度学术] 

40

Ohtsuka JImai MFukumura Met al. Non-propagative human parainfluenza virus type 2 nasal vaccine robustly protects the upper and lower airways against SARS-CoV-2[J]. iScience20212412):103379. [百度学术] 

41

Park JGOladunni FSRohaim MAet al. Immunogenicity and protective efficacy of an intranasal live-attenuated vaccine against SARS-CoV-2[J]. iScience2021249):102941. [百度学术] 

42

Qin XLi SLi Xet al. Development of an Adeno-Associated Virus-Vectored SARS-CoV-2 Vaccine and Its Immunogenicity in Mice[J]. Front Cell Infect Microbiol202212802147. [百度学术] 

43

TWJrDubenskyKanne DBLeong ML. Rationale,progress and development of vaccines utilizing STING-activating cyclic dinucleotide adjuvants[J]. Ther Adv Vaccines201314):131-143. [百度学术] 

44

An XYMartinez-Paniagua MRezvan Aet al. Single-dose intranasal vaccination elicits systemic and mucosal immunity against SARS-CoV-2[J]. iScience2021249):103037. [百度学术] 

45

Du YYXu YHFeng Jet al. Intranasal administration of a recombinant RBD vaccine induced protective immunity against SARS-CoV-2 in mouse[J]. Vaccine20213916):2280-2287. [百度学术] 

46

Graham BS. Rapid COVID-19 vaccine development[J]. Science20203686494):945-946. [百度学术] 

47

Alu AQChen LLei Het al. Intranasal COVID-19 vaccines:from bench to bed[J]. EBioMedicine202276103841. [百度学术] 

48

IndexNature. Inhalable vaccine in trials[EB/OL].[2022-11-30]. https://www.nature.com/articles/d42473-022-00043-y. [百度学术] 

49

Halperin SAYe LMacKinnon-Cameron Det al.Final efficacy analysis,interim safety analysis,and immunogenicity of a single dose of recombinant novel coronavirus vaccine (adenovirus type 5 vector) in adults 18 years and older:an international,multicentre,randomised,double-blinded,placebo-controlled phase 3 trial[J].Lancet202239910321):237-248. [百度学术] 

50

Bo XZ.Wantai Biology:Nasal spray influenza virus vector COVID-19 vaccine is included in emergency use[EB/OL].2022-12-06].https://news.sina.com.cn/s/2022-12-06/doc-imqmmthc7176550.shtml. [百度学术]