摘要
对青钱柳[Cyclocarya paliurus (Batalin)Iljinskaja]叶的乙醇提取物正丁醇萃取部位进行化学成分研究。综合应用硅胶、MCI、ODS、Sephadex LH-20柱色谱、半制备高效液相色谱等多种色谱技术进行分离纯化,从中分离得到8个糖苷类化合物。根据理化性质及光谱数据分别鉴定为3-乙基-4-甲基戊酯-O-β-D-呋喃芹糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、胡桃苷E(2)、(4S)-α-松油醇-8-O-α-L-呋喃阿拉伯糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、(4S)-α-松油醇-8-O-β-D-呋喃芹糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、丁子香酚-O-β-D-呋喃芹糖-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯(6)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄醛酸苷(7)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄醛酸苷(8)。其中化合物1为新化合物,化合物2 ~ 6为首次从青钱柳属中分离得到。
青钱柳[Cyclocarya paliurus (Batalin) Iljinskaja]是胡桃科青钱柳属落叶乔木,为我国特有的单种属植物[1],被誉为植物界的大熊猫、医学界的第三棵树,广泛分布于江苏、安徽、浙江、江西、福建等地[2]。青钱柳叶性温、味微苦,具有祛风止痛、杀虫止痒等功效,民间还发现它具有清热解毒、生津止渴、降压、强心,以致延年益寿的作用[3]。现代药理学研究表明青钱柳具有降血糖、降血压、降血脂、抗氧化等多种药理作用,可以有效防治糖尿病及心脑血管疾病等多种慢性疾病[4-5],显示出良好的应用前景。化学成分研究表明,青钱柳中含有三萜、黄酮、多糖等多种化学成分[6],但其药效物质基础尚未完全阐明。目前对青钱柳化学成分研究主要集中在中小极性部位,大极性部位研究较少。文献调研发现青钱柳提取物正丁醇萃取部位可明显降低小鼠肝脏自发性丙二醛的生成,减轻CCl4、H2O2、Fe2+-VitC所致的肝脏脂质过氧化反应,具有较强的体外抗脂质过氧化作用[7]。
为了进一步探索青钱柳不同药效部位活性成分及化学物质基础,本研究旨在深入挖掘青钱柳乙醇提取物正丁醇萃取部位中的活性成分,并从中分离纯化得到8个化合物,分别鉴定为3-乙基-4-甲基戊酯-O-β-D-呋喃芹糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、胡桃苷E(2)、(4S)-α-松油醇-8-O-α-L-呋喃阿拉伯糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、(4S)-α-松油醇-8-O-β-D-呋喃芹糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、丁子香酚-O-β-D-呋喃芹糖-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯(6)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄醛酸苷(7)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄醛酸苷(8)。其中化合物1为新化合物,化合物2 ~ 6为首次从青钱柳属中分离得到。
青钱柳叶采自南京林业大学种植基地,经中国药科大学中药资源学教研室秦民坚教授鉴定为青钱柳[Cyclocarya paliurus (Batalin) Iljinskaja],植物标本(L20201018)现存于中国药科大学中药制药系。
UV-2600i型紫外光谱仪(日本岛津公司);Tensor 27型红外光谱仪、Avance-500型核磁共振谱仪(德国布鲁克公司);Autopol IV旋光仪(美国鲁道夫公司);1260 Infinity高效液相色谱仪、Q-TOF-6520型质谱仪(美国安捷伦公司);半制备液相色谱仪(美国LabAlliance公司);5C18-AR-II制备、分析色谱柱(日本Cosmosil公司);100 ~ 200目、200 ~ 300目硅胶(青岛海洋化工厂);ODS RP-18硅胶、硅胶60 F254薄层色谱板(德国Merck公司);ODS RP-18柱(日本YMC公司);MCI树脂(日本三菱化学公司);Sephadex LH-20(美国Pharmacia公司);甲醇、乙腈(色谱级,上海星可高纯溶剂有限公司),实验用水(杭州娃哈哈集团有限公司),其他试剂均为市售分析纯。
取干燥后的青钱柳叶49.6 kg,加入80%乙醇,浸渍法提取3次,每次7 d。提取液合并后经减压浓缩至无醇味,得到粗浸膏(9.4 kg)。将粗浸膏悬浮在水中,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,得到各个萃取部位。取部分正丁醇萃取部位(1.3 kg)经D101大孔树脂柱色谱法,以乙醇-水梯度(0∶100→95∶5)洗脱得到7个组分(Fr.A ~ G)。Fr.B经硅胶(200 ~ 300目)柱色谱,以CHCl3-MeOH(100∶10→0∶100)洗脱得到Fr.B1 ~ B7。Fr. B3经Sephadex LH-20柱色谱、MCI柱色谱反复分离,最后经半制备HPLC等度洗脱纯化,得到化合物1(4.6 mg)、3(5.0 mg)、4(5.1 mg)、6(20.1 mg)。Fr.B4经Sephadex LH-20柱色谱、ODS反相柱色谱及硅胶柱色谱梯度洗脱,最后经半制备HPLC等度洗脱纯化,得到化合物2(12.9 mg)、5(3.5 mg)。Fr.B5经Sephadex LH-20柱色谱得到化合物7(7.6 mg)、8(12.7 mg)。化合物1 ~ 8的结构式见图1。
Figure 1 Chemical structures of compounds 1-8
黄色油状物(甲醇),[α]-57.0° (c 0.1,MeOH),易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂。香草醛-浓硫酸反应显黄色,Molish反应呈阳性,酸水解检出D-葡萄糖和D-芹糖,推测其为糖苷类化合物。HR-TOF-MS显示准分子离子峰m/z:461.199 36[M + Na]+ (calcd for C19H34O11Na,461.199 33),确定其分子式为C19H34O11,相对分子质量为438。UV(CH3OH)λmax 222 nm;IR(KBr ν):3 393.6,2 932.6,1 745.2,1 074.3 cm-1。
1H NMR谱显示其含有3个甲基氢信号δ 1.00(3H,t,J = 7.7 Hz)、0.99(3H,d,J = 6.8 Hz)和0.96(3H,d,J = 6.8 Hz)。13C NMR显示该化合物有19个碳信号,其中δ 174.4为酯羰基碳信号,δ 19.8、19.0、12.0为甲基碳信号。1H NMR谱亦显示δ 5.54(1H,d,J = 8.2 Hz)、5.05(1H,d,J = 2.2 Hz)的糖端基质子信号,δ 4.04 ~ 3.39为糖环上其他氢信号。13C NMR谱显示对应的糖端基碳信号δ 111.0、95.2,糖环上其他连氧碳信号δ 80.6 ~ 65.8。综合上述信息,结合酸水解结果,并与文献报道的葡萄糖和芹糖数据[8]对照,说明化合物1结构中含有一个β-D-葡萄糖和一个β-D-芹糖。将化合物1的碳氢数据与文献报道的3-ethyl-4-methyl pentanol-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside[8]对照,两者核磁数据接近,差别在于化合物1的C-1、C-1'位碳信号不同,故推测化合物1是C-1位连酯羰基的3-乙基-4-甲基戊酯糖苷。
化合物1的平面结构可通过HSQC、1H-1H COSY、HMBC图谱数据解析确定。1H-1H COSY谱显示,δH-3 1.83 ~ 1.80与δH-2b 2.50和δH-2a 2.34均有相关信号,结合碳谱信号,H-2与酯羰基相连;δH-3 1.83 ~ 1.80、δH-6 0.99和δH-5 0.96与δH-4 1.88 ~ 1.84有相关信号,形成H-3/H-4/H-5、6的侧链连接方式;δH-7b 1.52、δH-7a 1.40与δH-3 1.83 ~ 1.80、δH-8 1.00有相关信号,形成H-3/H-7/H-8的侧链连接方式。HMBC谱中的δH-2b 2.50、δH-2a 2.34与δ 174.4相关信号,证实δ 174.4为与C-2位相连的酯羰基碳信号。糖的连接位置和顺序可通过HMBC谱确定,δH-1' 5.54与δC-1 174.4的相关信号证实葡萄糖连接在苷元的1位,δH-1″与δC-6' 68.3以及δH-6'b 4.04 ~ 4.02、δH-6'a 3.70与δC-1″ 111.0的相关信号证实阿拉伯糖连接在葡萄糖的6'位。
Figure 2 Key 1H-1H COSY and HMBC (H→C) correlations of compound 1
综合上述解析,化合物1的结构确定为3-乙基-4-甲基戊酯-O-β-D-呋喃芹糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷,即3-ethyl-4-methyl-pentyl ester-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside,经Scifinder检索为一新化合物。化合物1的NMR波谱数据全归属见表1。
Table 1
NMR spectroscopic data of compound 1 (500 and 125 MHz, CD3OD, J in Hz)
Position | δH a) | δC b) | 1H-1H COSY | HMBC (H→C) |
1 |
- |
174.4 |
- |
- |
2 |
2.34(dd, 15.6, 7.4), 2.50 (dd, 15.6, 5.9) |
36.6 |
H-3 |
C-1, 3, 4, 7 |
3 |
1.83-1.80(m) |
43.7 |
H-2, 4 |
C-1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 |
4 |
1.88-1.84(m) |
30.7 |
H-3, 5, 6 |
C-2, 3, 5, 6, 7 |
5 |
0.96(d, 6.8) |
19.0 |
- |
C-3, 4, 6 |
6 |
0.99(d, 6.8) |
19.8 |
- |
C-3, 4, 5 |
7 |
1.40(m), 1.52(m) |
24.7 |
H-3, 8 |
C-2, 3, 4, 8 |
8 |
1.00(t, 7.7) |
12.0 |
- |
C-3, 7 |
Glc-1' |
5.54(d, 8.2) |
95.2 |
H-2' |
C-1 |
2' |
3.42-3.39 c) |
74.0 |
H-1' |
C-1', 3' |
3' |
3.49(dd, 9.0, 9.0) |
78.1 |
H-2', 4' |
C-1', 2', 4' |
4' |
3.44-3.40 c) |
71.3 |
H-3', 5' |
C-1', 3', 5', 6' |
5' |
3.59(ddd, 9.7, 5.7, 2.0) |
77.7 |
H-4', 6' |
C-1', 3', 6' |
6' |
3.70(dd, 11.5, 5.7), 4.04-4.02 c) |
68.3 |
H-5' |
C-4', 5', 1″ |
Api-1″ |
5.05(d, 2.2) |
111.0 |
H-2″ |
C-6', 3″, 4″ |
2″ |
3.98(d, 2.2) |
78.0 |
H-1″ |
C-1″, 4″, 5″ |
3″ |
- |
80.6 |
- |
- |
4″ |
3.84(d, 9.6), 4.04(d, 9.6) |
75.1 |
- |
C-1″, 2″, 3″, 5″ |
5″ |
3.67(s) |
65.8 |
- |
C-2″, 3″, 4″ |
a) Measured at 500 MHz; b) Measured at 125 MHz; c) Overlapped signals; Glc: glucopyranosyl; Api: apiofuranosyl.
淡黄色无定型粉末,易溶于甲醇,紫外254 nm下有暗斑,365 nm下有黄色荧光,浓硫酸-香草醛反应显粉色,Molish反应呈阳性。分子式为C16H20O9,相对分子质量为356。1H NMR(CD3OD,500 MHz) δ:7.62(1H,d,J = 9.0 Hz,H-6),6.96(1H,d,J = 9.0 Hz,H-7),5.45(1H,t,J = 3.0 Hz,H-4),4.89(1H,d,J = 7.6 Hz,H-1'),3.99(1H,m,H-6'b),3.81(1H,m,H-6'a),3.54(1H,m,H-2'),3.48(1H,m,H-3'),3.45(3H,m,H-4'),3.44(1H,m,H-5'),3.16(1H,m,H-2a),2.62(1H,m,H-2b),2.34(1H,m,H-3a),2.30(1H,m,H-3b)。13C NMR(CD3OD,125 MHz) δ:206.5(C-1),33.6(C-2),30.3(C-3),61.3(C-4),148.9(C-5),128.5(C-6),119.0(C-7),159.1(C-8),116.2(C-9),134.8(C-10),104.6(C-1'),75.4(C-2'),78.0(C-3'),71.4(C-4'),78.4(C-5'),62.6(C-6')。以上波谱数据与文献[9]对照基本一致,故确定化合物2为胡桃苷 E(juglanoside E)。
黄色油状物(甲醇),易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂。香草醛-浓硫酸反应显紫色,Molish反应呈阳性。相对分子质量448,分子式C21H36O10。1H NMR(CD3OD,500 MHz) δ:5.45(1H,br.s,H-2),5.01(1H,d,J = 1.5 Hz,H-1″),4.56(1H,d,J = 7.5 Hz,H-1'),4.08 ~ 4.04(3H,overlapped,H-6'a,2″,4″),3.92(1H,dd,J = 5.7,3.1 Hz,H-3″),3.83(1H,dd,J = 11.8,3.3 Hz,H-5″a),3.73(1H,dd,J = 11.8,5.1 Hz,H-5″b),3.65(1H,dd,J = 10.9,5.8 Hz,H-6'b),3.48(1H,ddd,J = 10.9,5.8,2.5 Hz,H-5'),3.42(1H,overlapped,H-3'),3.37(1H,overlapped,H-4'),3.23(1H,dd,J = 9.2,7.5 Hz,H-2'),2.21 ~2.07(3H,overlapped,H-3a,5a,6a),2.01(1H,dd,J = 15.9,5.5 Hz,H-6b),1.89(1H,m,H-3b),1.78(1H,dd,J = 11.7,4.1 Hz,H-4),1.72(3H,s,H-7),1.34 ~ 1.31(1H,overlapped,H-5b),1.32(3H,s,H-10),1.28(3H,s,H-9)。13C NMR(CD3OD,125 MHz) δ:134.9(C-1),121.9(C-2),28.1(C-3),45.1(C-4),25.2(C-5),32.1(C-6),23.6(C-7),81.1(C-8),23.0(C-9),25.1(C-10),98.6(C-1'),75.3(C-2'),78.3(C-3'),72.1(C-4'),76.2(C-5'),68.3(C-6'),109.9(C-1″),83.1(C-2″),79.0(C-3″),86.0(C-4″),63.1(C-5″)。以上波谱数据与文献[10]对照基本一致,故确定化合物3为(4S)-α-松油醇-8-O-α-L-呋喃阿拉伯糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
黄色油状物(甲醇),易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂。香草醛-浓硫酸反应显紫色,Molish反应呈阳性。相对分子质量448,分子式C21H36O10。1H NMR(CD3OD,500 MHz) δ:5.45(1H,br.s,H-2),5.05(1H,d,J = 2.2 Hz,H-1″),4.54(1H,d,J = 7.7 Hz,H-1'),4.04(1H,d,J = 9.8 Hz,H-3″),4.01(1H,dd,J = 10.9,1.9 Hz,H-6'a),3.94(1H,d,J = 2.2 Hz,H-2″),3.84(1H,d,J = 9.8 Hz,H-4″),3.66(2H,s,H-5″),3.67 ~ 3.61(1H,overlapped,H-3'),3.44-3.40(2H,overlapped,H-4',6'b),3.39-3.31(1H,overlapped,H-5'),3.22(1H,dd,J = 9.1,7.7 Hz,H-2'),2.21 ~ 2.09(3H,overlapped,H-3a,5a,6a),2.00(1H,dd,J = 16.0,5.4 Hz,H-6b),1.94 ~ 1.83(1H,m,H-3b),1.78(1H,m,H-4),1.72(3H,s,H-7),1.32(3H,s,H-10),1.27(3H,s,H-9),0.97(1H,dd,J = 14.4,5.4 Hz,H-5b)。13C NMR(CD3OD,125 MHz) δ:134.9(C-1),121.9(C-2),28.1(C-3),45.1(C-4),25.1(C-5),32.1(C-6),23.6(C-7),81.1(C-8),25.2(C-9),23.0(C-10),98.6(C-1'),75.4(C-2'),78.4(C-3'),71.9(C-4'),76.4(C-5'),68.8(C-6'),111.0(C-1″),78.1(C-2″),80.6(C-3″),75.1(C-4″),65.9(C-5″)。以上波谱数据与文献[11]对照基本一致,故确定化合物4为(4S)-α-松油醇-8-O-β-D-呋喃芹糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
黄色油状物(甲醇),易溶于甲醇等有机溶剂。香草醛-浓硫酸反应显黄色,Molish反应呈阳性。相对分子质量458,分子式C21H30O11。1H NMR(CD3OD,500 MHz) δ:7.13(1H,d,J = 8.2 Hz,H-6),6.88(1H,d,J = 2.0 Hz,H-3),6.80(1H,dd,J = 8.2,2.0 Hz,H-5),6.01(1H,ddt,J = 16.8,10.1,6.7 Hz,H-8),5.12(1H,br dd,J = 16.8,1.8 Hz,H-9a),5.08(1H,br dd,J = 10.1,1.8 Hz,H-9b),5.02(1H,d,J = 2.4 Hz,H-1″),4.85(1H,d,J = 7.3 Hz,H-1'),4.04(1H,dd,J = 11.2,1.9 Hz,H-6'a),3.99(1H,d,J = 9.6 Hz,H-4″a),3.94(1H,d,J = 2.4 Hz,H-2″),3.90(3H,s,2-OMe),3.79(1H,d,J = 9.6 Hz,H-4″b),3.67(1H,dd,J = 11.2,6.5 Hz,H-6'b),3.62(2H,s,H-5″),3.58(1H,ddd,J = 8.7,6.5,1.9 Hz,H-5'),3.55 ~ 3.47(2H,overlapped,H-3',4'),3.41-3.37(3H,overlapped,H-2',7)。13C NMR(CD3OD,125 MHz) δ:146.3(C-1),150.8(C-2),118.5(C-3),136.6(C-4),122.2(C-5),114.2(C-6),40.8(C-7),139.0(C-8),115.9(C-9),56.8(2-OMe),103.2(C-1'),74.9(C-2'),78.0(C-3'),71.6(C-4'),77.8(C-5'),68.7(C-6'),111.0(C-1″),77.0(C-2″),80.5(C-3″),75.0(C-4″),65.6(C-5″)。以上波谱数据与文献[12]对照基本一致,故确定化合物5为丁子香酚-O-β-D-呋喃芹糖-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
黄色针状结晶(甲醇),易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂。香草醛-浓硫酸反应显黄色,盐酸-镁粉反应和Molish反应呈阳性。ESI-MS显示准分子离子峰m/z:475.078 88[M - H]⁻,确定其相对分子质量为476,分子式C22H20O12。1H NMR(DMSO-d6,500 MHz) δ:12.50(1H,s,5-OH),10.87(1H,br.s,7-OH),10.18(1H,br.s,4'-OH),8.01(2H,d,J = 9.0 Hz,H-2',H-6'),6.88(2H,d,J = 9.0 Hz,H-3',H-5'),6.44(1H,d,J = 2.0 Hz,H-8),6.22(1H,d,J = 2.0 Hz,H-6),5.46(1H,d,J = 7.5 Hz,H-1″),3.57(3H,s,OMe)。13C NMR(DMSO-d6,125 MHz) δ:156.4(C-2),133.0(C-3),177.2(C-4),161.2(C-5),98.8(C-6),164.3(C-7),93.7(C-8),156.6(C-9),103.9(C-10),120.6(C-1'),130.9(C-2'),115.1(C-3'),160.1(C-4'),115.1(C-5'),130.9(C-6'),101.4(C-1″),73.9(C-2″),75.5(C-3″),71.4(C-4″),75.6(C-5″),168.9(C-6″),51.8(OMe)。以上波谱数据与文献[13]对照基本一致,故确定化合物6为山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯。
黄色无定型粉末(甲醇),易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂。香草醛-浓硫酸反应显黄色,盐酸-镁粉反应和Molish反应呈阳性。相对分子质量462,分子式C21H18O12。1H NMR(DMSO-d6,500 MHz) δ:12.49(1H,s,5-OH),8.02(2H,d,J = 8.9 Hz,H-2',H-6'),6.84(2H,d,J = 8.9 Hz,H-3',H-5'),6.30(1H,d,J = 2.0 Hz,H-8),6.09(1H,d,J = 2.0 Hz,H-6),5.46(1H,d,J = 7.4 Hz,H-1″),3.34 ~ 3.18(4H,overlapped,H-2″-5″)。13C NMR(DMSO-d6,125 MHz) δ:156.3(C-2),133.1(C-3),177.4(C-4),161.0(C-5),98.6(C-6),164.5(C-7),93.7(C-8),156.3(C-9),103.7(C-10),120.8(C-1'),131.0(C-2'),115.0(C-3'),159.9(C-4'),115.0(C-5'),131.0(C-6'),101.0(C-1″),74.0(C-2″),76.3(C-3″),72.0(C-4″),74.4(C-5″),171.7(C-6″)。以上波谱数据与文献[13]对照基本一致,故确定化合物7为山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷。
黄色无定型粉末(甲醇),易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂。香草醛-浓硫酸反应显黄色,盐酸-镁粉反应和Molish反应呈阳性。相对分子质量478,分子式C21H20O13。1H NMR(DMSO-d6,500 MHz) δ:8.27(1H,d,J = 2.3 Hz,H-2'),7.35(1H,dd,J = 8.4,2.3 Hz,H-6'),6.82(1H,d,J = 8.4 Hz,H-5'),6.36(1H,d,J = 2.0 Hz,H-8),6.17(1H,d,J = 2.0 Hz,H-6),5.27(1H,d,J = 6.9 Hz,H-1″),3.40(1H,d,J = 9.2 Hz,H-5″),3.27 ~ 3.20(3H,overlapped,H-2″-4″)。13C NMR(DMSO-d6,125 MHz) δ:157.5(C-2),133.9(C-3),177.5(C-4),160.9(C-5),98.9(C-6),164.8(C-7),93.7(C-8),156.5(C-9),103.6(C-10),120.6(C-1'),118.0(C-2'),144.8(C-3'),148.4(C-4'),115.4(C-5'),120.5(C-6'),102.8(C-1″),74.1(C-2″),76.6(C-3″),71.8(C-4″),74.2(C-5″),172.0(C-6″)。以上波谱数据与文献[14]对照基本一致,故确定化合物8为槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷。
目前对青钱柳叶化学成分研究集中在中小极性部位,结构类型主要为三萜类和黄酮类化合物,现已从中分离得到超过250个单体成分,但对青钱柳叶中大极性部位研究较少。为了进一步探索青钱柳叶不同药效部位活性成分及化学物质基础,本研究对青钱柳叶的正丁醇萃取部位进行了化学成分初步研究,分离并鉴定了8个化合物,其中化合物1为新化合物,化合物2 ~ 6为首次从青钱柳属中分离得到。本研究结果丰富了青钱柳叶大极性部位的化学物质基础,为其药用价值的利用开发提供了数据支撑。但本研究对青钱柳叶的化学物质基础研究还不够全面,且未对所分离得到的化合物进行药理活性研究,有待后续继续深入探索。
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