摘要
以CoCl2刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立细胞异常缺氧损伤模型,探究肝素寡糖(HDO)对HUVEC细胞中糖酵解的影响及分子机制。实验分为对照组(无血清DMEM培养基)、模型组(无血清DMEM培养基+50 μmol/L CoCl2)及HDO给药组(模型组基础上分别添加0.01、0.1、1 μmol/L HDO)。采用生化试剂盒检测HDO对HUVEC细胞葡萄糖摄取及乳酸积累的影响;采用Western blot及qPCR实验检测HIF-1α、GLUT-1及LDHA基因转录和蛋白表达的影响,并对PI3K/Akt信号通路进行检测。结果显示:HDO可以抑制HUVEC细胞的葡萄糖摄取及乳酸生成,下调HIF-1α、GLUT-1及LDHA的表达水平,影响PI3K/Akt信号通路的激活。结果表明,HDO可以通过抑制PI3K/Akt/HIF-1α信号轴的激活从而调控HUVEC细胞的糖酵解水平。
肝素主要用于临床上抗血栓治疗。相关证据表明,使用肝素及低分子肝素可以为肿瘤患者带来更大的生存优势,其通过抑制细胞增殖、迁移、血管生成等非凝血途径发挥治疗作
肝素寡糖(heparin-derived oligosaccharide,HDO)是指由未分级肝素降解并分离纯化得到的一种低和窄相对分子质量分布的寡糖片段。前期研究发现实验室自制的HD
HDO(实验室自制,3.2 kD);CoCl2•6H2O(国药集团化学试剂有限公司);高糖DMEM培养基、FBS、胰蛋白酶(美国Gibco公司);胰蛋白酶(安徽Biosharp生物公司);葡萄糖测试盒、乳酸测试盒、乳酸脱氢酶测试盒(南京建成生物工程研究所);β-actin抗体、抗GLUT-1抗体、抗LDHA抗体、抗PI3K抗体、抗Akt抗体、抗p-Akt抗体、抗HIF-1α抗体、HRP标记山羊抗兔二抗(美国Immunoway公司);0.45 μm聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜、青霉素-链霉素双抗溶液、ECL化学发光液、BCA蛋白定量试剂盒、预染蛋白质分子量标准(Marker)、RIPA裂解液强(上海碧云天生物公司);TriQuick总RNA提取试剂(北京索莱宝公司);180 kD预染蛋白质Marker、蛋白胶预混液(10%)、HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA 合成试剂盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物公司),其他试剂均为市售分析纯。
HUVEC细胞在含10% FBS的高糖DMEM培养基中培养,培养箱参数设置为37 ℃、5% CO2、饱和湿度。传代周期:2 ~ 3 d。
实验分为对照(control)组(无血清DMEM培养基)、模型(model)组(无血清DMEM培养基+50 μmol/L CoCl2)及HDO给药组(模型组基础上分别添加0.01、0.1、1 μmol/L HDO)。将处于对数生长期且状态良好的HUVEC细胞常规消化处理,并调整细胞密度铺6孔板,待细胞贴壁生长至70% ~ 80%融合时,弃去旧培养基并分别加入各分组培养基。继续培养24 h,进行后续实验。
细胞培养和分组情况同“2.1”项。细胞处理24 h后,收集各组细胞培养上清液,1 000 r/min,离心5 min,吸取上清液,分别使用葡萄糖测试盒和乳酸测试盒测定计算葡萄糖摄取量和乳酸含量。
细胞培养和分组情况同“2.1”项。细胞处理24 h后,胰酶消化收集各组细胞并用PBS清洗2次,随后每组细胞加入PBS溶液0.2 mL,冰浴,超声破碎裂解细胞,功率300 W,每次4 s,重复3次,间隔30 s。随后取细胞匀浆液按照BCA法测定蛋白浓度,并使用乳酸脱氢酶测试盒测定计算乳酸脱氢酶酶活力。
细胞培养及分组情况同“2.1”项。细胞处理24 h后,胰酶消化收集各组细胞,用预冷PBS洗涤细胞2次,3 000 r/min,4 ℃离心10 min,弃去上清液;加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA细胞裂解液,提取细胞总蛋白;采用BCA法测定蛋白含量;之后按照蛋白胶预混液试剂盒说明书进行 SDS-PAGE电泳;电泳结束后立即转移蛋白至PVDF膜; 5%脱脂奶粉室温封闭2 h;4 ℃ 孵育HIF-1α、GLUT-1、LDHA、PI3K、Akt、p-Akt一抗(稀释比1∶500)过夜;TBST洗膜4次,每次5 min;室温孵育二抗(稀释比1∶5 000)1 h;TBST洗膜4次,每次5 min;加ECL曝光液用化学发光分析系统采集图像。
细胞培养及分组情况同“2.1”项。细胞处理24 h后,按照TriQuick总RNA提取试剂说明书提取细胞总RNA,采用Nanodrop测定浓度及纯度,使用逆转录试剂按照说明书将RNA逆转录为cDNA,在NCBI上查找各目的基因mRNA序列,设计引物序列如
Primer | Forward primer (5′→3′) | Reverse primer (5′→3′) |
---|---|---|
GLUT-1 | ATTGGCTCCGGTATCGTCAAC | GCTCAGATAGGACATCCAGGGTA |
LDHA | ATGGCAACTCTAAAGGATCAGC | CCAACCCCAACAACTGTAATCT |
HIF-1α | GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCG | CCTTATCAAGATGCGAACTCACA |
β-actin | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
在肿瘤细胞、快速增殖的组织细胞及缺氧环境下的正常细胞中,细胞需要从外部摄取更多葡萄糖用于支持自身对能量的过度需

Figure 1 Heparin-derived oligosaccharide (HDO) inhibited glucose uptake in hypoxic HUVEC cells ()
#P < 0.05 vs control group;
乳酸是糖酵解的代谢产物,能以多种方式促进肿瘤进展,包括促肿瘤生长转移、血管生成、肿瘤浸润与肿瘤免疫

Figure 2 HDO inhibited lactic acid accumulationin in hypoxic HUVEC cells ()
##P < 0.01 vs control group;
GLUT-1的高水平表达与肿瘤细胞的恶性生长和不良预后密切相

Figure 3 HDO inhibited the expression of GLUT-1 in hypoxic HUVEC cells ()
A: Relative expression of GLUT-1 mRNA detect by qPCR; B: Expression of GLUT-1 protein detected by Western blot; C: Ratio of GLUT-1/β-actin
LDH催化糖酵解途径的最后一步,可以将丙酮酸转化为乳酸。研究证明,LDHA在许多类型的癌症中过度表达,靶向LDHA会抑制肿瘤进

Figure 4 HDO inhibited the expression of LDHA in hypoxic HUVEC cells )
A: Relative expression of LDHA mRNA detected by qPCR; B: Expression of LDHA protein detected by Western blot; C: Ratio of LDHA/β-actin; D: LDH enzyme activity
HIF-1是细胞适应氧稳态的主要调节因子,HIF-1α在常氧中几乎不表达,而缺氧会诱导HIF-1α的发生从而与稳定表达的HIF-1β形成复合物,该复合物进一步通过与下游靶基因启动子上的缺氧反应元件结合调控细胞内诸多基因的转录表达从而使细胞适应缺氧环境。缺氧刺激HUVEC细胞24 h可以显著升高HIF-1α的mRNA相对表达水平,而HDO治疗后可以抑制缺氧导致的HIF-1α mRNA相对表达水平的上调并且这种抑制作用具有剂量依赖性(

Figure 5 HDO inhibited the expression of HIF-1α in hypoxic HUVEC cells ()
A: Relative expression of HIF-1α mRNA detected by qPCR; B: Expression of HIF-1α protein detected by Western blot; C: Ratio of HIF-1α/β-actin
PI3K/Akt在许多细胞中介导细胞增殖、代谢及炎症等多种病理生理过程。许多靶向PI3K/Akt通路的抑制剂已经显示出下调HIF-1表达的作用。PI3K-Akt通路与血管生成及细胞糖酵解之间的联系已在许多研究中得到证实。因此本研究接下来通过Western blot实验,检测HDO对缺氧HUVEC细胞中PI3K/Akt通路的影响。CoCl2缺氧刺激可以显著诱导HUVEC细胞中PI3K的表达及Akt的磷酸化,在加入HDO药物治疗后可以显著抑制PI3K/Akt通路的激活,其中高浓度HDO的抑制效果最好(

Figure 6 HDO inhibited the activation of PI3K/Akt signaling pathway in hypoxic HUVEC cells ()
A: Expression of PI3K/Akt signaling pathway protein detected by Western blot; B: Ratio of PI3K/β-actin; C: Ratio of p-Akt/Akt
在肿瘤细胞、快速增殖的组织细胞及处于缺氧环境下的正常细胞会利用糖酵解作为主要的供能方式。该方式可以将细胞摄入的大量葡萄糖转化为乳酸从而满足细胞的能量需求及合成代谢需求,此外,细胞糖酵解过程中产生的大量乳酸可以分解破坏细胞外基质促使细胞侵袭转
大量数据表明肝素及低相对分子质量肝素具有抗凝活性以外的抗肿瘤活性。前期实验室通过亚硝酸降解未分级肝素并分离纯化后得到一种相对分子质量约为3 200的十二糖片段——肝素寡糖(HDO),并表明此HDO具有抑制内皮细胞增殖、迁移及血管生成的作
GLUT-1是一种限速葡萄糖转运蛋白,可以将胞外葡萄糖运输至胞内,在肿瘤细胞及增殖迅速的正常细胞中GLUT1的过表达与细胞的侵袭与转移密切相
PI3K/Akt调节广泛的细胞活动,包括细胞存活、增殖、代谢、运动和肿瘤进展。Xiao
综上,本研究发现HDO通过影响HUVEC细胞糖酵解途径从而发挥抗肿瘤活性,具体来说,HDO可以抑制PI3K/Akt/HIF-1α通路的激活进一步调控下游靶基因GLUT-1及LDHA的表达,从而抑制HUVEC细胞的葡萄糖摄取及乳酸生成能力。该研究为推进HDO在抗肿瘤及治疗缺氧损伤相关疾病中的应用提供实验依据,但还应对以下几点继续深入探究:(1)HDO调控HIF-1α表达的具体机制;(2)HDO在缺氧损伤引起的细胞凋亡、肿瘤细胞免疫逃逸中的作用;(3)HDO在体内缺氧模型中的作用。
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