吸入用瑞德西韦脂质体的制备及其体外评价
Preparation and in vitro characterization of remdesivir-loaded liposomes for inhalation
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摘要: 制备吸入用瑞德西韦脂质体并对其体外性质进行评价。首先对瑞德西韦脂质体制备方法进行考察，通过单因素实验确定了制剂的处方组成和制备工艺。然后对瑞德西韦脂质体吸入剂的基本性质、体外沉积性质和空气动力学粒径等进行了全面评价。结果显示，以薄膜分散法制备并以pH 6.5磷酸盐缓冲液为水化介质制得的脂质体其粒径较小、包封率高、48 h几乎无沉淀产生。优化后的处方中药物与二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）的比例为1∶20，胆固醇占总脂材的10%，并加入20%二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-mPEG 2000）以提高脂质体稳定性。在冷冻干燥过程中加入4%海藻糖作为冻干保护剂，得到的冻干剂具有理想的外观并且复溶前后粒径变化较小、稳定性良好。透射电镜下观察到脂质体的微观形态呈表面光滑的球状结构，且粒径分布均匀。体外释放显示，经雾化器雾化前后脂质体混悬液的释放曲线无明显改变；体外沉积性质考察表明，使用新一代撞击器测得的细颗粒占51.4%，质量中值空气动力学粒径小于5 μm。实验结果表明，吸入用瑞德西韦脂质体具有良好的包封率和稳定性，雾化后的脂质体混悬液粒度分布均匀，能够有效地在肺部沉积，为新型冠状病毒肺炎的治疗提供了新的思路。Abstract: Remdesivir-loaded liposomes for inhalation were prepared and the in vitro properties were evaluated. Firstly, preparation methods of remdesivir-loaded liposomes were screened, and single-factor experiments were conducted to optimize the prescription and preparation process. Then the physical property, deposition ratio and aerodynamic particle size distribution of remdesivir-loaded liposomes suspension for inhalation were comprehensively evaluated. As a result, the optimal liposomes were prepared by the thin-film dispersion method with pH 6.5 phosphate-buffered saline as the hydration medium. In the prescription, the ratio of drug to DPPC was 1∶20; the cholesterol accounted for 10% of total lipids; and 20% DSPE-mPEG 2000 was added as stabilizer.4% trehalose was added as lyoprotectant when lyophilizing to obtain ideal appearance, good stability and a small particle size change after reconstitution. Remdesivir-loaded liposomes were spherical with smooth surface and uniform particle size distribution under transmission electron microscope. In vitro release tests showed no significant change for release curves of remdesivir-loaded liposomes suspension before and after nebulization. Deposition experiments indicated that the fine particles fraction of liposomes was 51.4%, and the mass median aerodynamic diameter was less than 5 μm measured by next generation impactor. To sum up, remdesivir-loaded liposomes for inhalation with high encapsulation efficiency and stability can achieve a suitable particle size distribution to effectively deposit in the lung after nebulization, which provides a new approach for the treatment of COVID-19.
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Keywords:
- remdesivir /
- liposomes /
- inhalation /
- preparation /
- aerodynamics
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免疫系统对于人体健康至关重要。自身免疫性疾病，如银屑病、炎症性肠病、多发性硬化症及类风湿性关节炎等，是一类机体对自身抗原发生免疫反应而损害自身组织的疾病，具有发病机制复杂、诱因众多、病程持久等特点，极大增加了临床有效药物的开发难度，银屑病甚至被称为“不死的癌症”。近年来，越来越多的研究表明炎症因子IL-17的过量产生促进自身免疫性疾病的发生，因此针对减少IL-17产生的治疗方案不断涌现并取得了较好的疗效[1-2]。2015年，IL-17a单克隆抗体secukinumab获FDA批准上市，用于治疗成人的中重度斑块状银屑病[3]。随后，ixekizumab（2016年）[4]、brodalumab（2017年）[5]和bimekizumab（2020年）[6]相继上市。以此为契机，视黄酸受体相关孤儿受体-γt（RORγt）作为IL-17生成的关键转录因子，其小分子抑制剂用于治疗自身免疫性疾病的可行性也得到了充分的理论验证。
1. 核受体RORγt
核受体（nuclear receptors，NRs）超家族负责编码数量庞多的转录因子，在代谢炎症反应、昼夜节律等类重要生理过程中发挥关键的调节作用[7]。视黄酸相关孤儿受体（ROR）属于配体依赖的转录因子核受体超家族的一员，包括RORα、RORβ和RORγ 3种亚型。其中RORα表达于多种器官中，在脑组织中表达水平最高，与炎症反应和抗肿瘤等相关[8−10]；RORβ表达在大脑及视网膜的某些区域，对于该亚型受体的作用研究较少，部分报道显示其在哺乳动物远程神经元的连接和分化过程中起到关键作用[11−12]；RORγ主要表达于胸腺、胰腺和肝等器官，其中胸腺特异性表达的RORγ称为RORγt，在免疫功能中发挥重要作用[13−14]。
1.1 RORγt结构
RORγt由可变的N-端区域（A/B区，N-terminal domian，NTD）、DNA结合域（C区，DNA-binding domain，DBD）、铰链区（D区）以及C-端的配体结合域（E/F区，ligand-binding domain，LBD）四部分构成[15]（图1）。A/B结构区位于RORγt蛋白氨基末端，含有非配体依赖的活性功能区 1（activation function 1，AF1），该功能区对于不同亚型的DNA结合特异性具有重要作用[16]。C结构区是高度保守的 DNA 结合区（DBD），其中包含两个半胱氨酸丰富的锌指结构，分别起到识别核心基序以及结合DNA响应元件（RORγ genomic DNA response element，RORE）中5′-AT富集区域的作用，决定了 DNA的结合活性[13]。D结构区是一段相对短小的柔性铰链区，上承C端的DBD，下接E/F端的LBD。位处于羧基末端(C端)的E/F区是由12个α螺旋（H1-H12）以及两个α螺旋（H2′和H11′）以及2~3个β折叠构成的3层折叠结构。该区域具有一段LBD配体依赖的活性功能区2（activation function 2，AF-2），其可以通过采取不同的构象与配体结合，来招募/排斥共刺激因子或共抑制因子来调控下游靶基因的转录[17]。因此，LBD区域的结构改变决定了RORγt蛋白的转录功能。当RORγt反向激动剂结合时，AF2可以通过抑制共刺激因子的招募或增加共抑制因子的招募，起到减少IL-17生成的作用。
1.2 RORγt生物学功能
RORγt位于经典的JAK-STAT3信号通路，其转录活性会受基因表达调控及泛素化/乙酰化修饰影响。在其转录过程中，首先酪氨酸激酶（JAKs）接收细胞因子IL-23或IL-6的信号，招募并磷酸化转录因子STAT3，使其以二聚体形式进入细胞核与Rorc基因结合，调控RORγt蛋白的转录过程（图2）。翻译生成的RORγt若被肿瘤坏死因子关联因子5（TRAF5）、Itchy E3泛素蛋白连接酶(ITCH)、泛素E3蛋白连接酶组分N端识别蛋白（UBR5）等E3连接酶泛素化识别标记，进入泛素-蛋白酶体系统（UPS）途径降解，亦或是在组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的作用下去乙酰化，则无法发挥转录活性[18]。与之相反，RORγt蛋白若是由组蛋白乙酰化酶p300等乙酰化修饰，则可以稳定结合于Il17a基因座，开启IL-17的转录过程[19]。在IL-17的转录过程中，首先由T细胞受体接受提呈的抗原，活化T细胞。紧接着干扰素调节因子4（IRF4）与碱性亮氨酸拉链转录因子（BATF）在T细胞活化过程早期打开染色质，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）直接结合RORγt，招募p300乙酰化RORγt蛋白。同时在核因子κb抑制因子ζ（Iκbζ）、人类相关转录因子1（RUNX1）等转录因子的辅助下，RORγt发挥转录活性，产生IL-17[20]。因上述调节过程，RORγt被认为是Th17细胞分化和IL-17产生过程的重要转录因子。Th17细胞及其释放的炎性因子IL-17在银屑病、类风湿性关节炎及炎性肠病等自身免疫性疾病的发生发展中起到关键性作用[21−22]。因此抑制RORγt可降低Th17细胞的分化以及IL-17的产生，从而起到治疗自身免疫性疾病的目的，是当前自身免疫性疾病药物研发的热点领域。
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图 2 RORγt的生物学功能BATF：碱性亮氨酸拉链转录因子；JAKs：酪氨酸激酶；HDAC：组蛋白去乙酰化酶；HIF-1α：缺氧诱导因子-1α；IL：白介素；IRF4：干扰素调节因子4； Iκbζ：核因子κb抑制因子ζ； RUNX1：人类相关转录因子1；STAT3：信号转导因子和转录激活因子3；TRAF5：肿瘤坏死因子关联因子5；UBR5：泛素E3蛋白连接酶组分N端识别蛋白；UPS：泛素-蛋白酶体系统2. 处于临床研究阶段的RORγt反向激动剂
RORγt抑制剂的发展过程起源于T0901317（1）的发现。该化合物最初被定义为一种有效的肝脏X受体（liver X receptor, LXR）激动剂，随后被报道具有RORγ反向激动活性（图3）[23]。在RORγ Gal4测试中，T0901317可作为RORγ（IC50 = 1.7 μmol/L）和RORα（IC50 = 2.0 μmol/L）的双重反向激动剂。后续发现的SR2211（RORγ Gal4, IC50 = 0.32 μmol/L）和SR1555（RORγ Gal4, IC50 = 1.5 μmol/L）均是没有LXR活性的RORγ选择性反向激动剂[24]，且SR2211在小鼠胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）模型中显示出体内药效[25]。
此后，有关RORγt小分子反向激动剂的专利或文献被大量报道。截至2023年11月，共有3个候选药物处于临床试验阶段，其中有2个候选药物处于临床Ⅱ期，1个候选药物处于临床Ⅰ期，适应证均为银屑病（表1）。
表 1 用于自身免疫疾病治疗的RORγt反向激动剂临床研究现状药物名称 全球状态 原研公司 适应证 BI730357 临床Ⅱ期 Boehringer Ingelheim 银屑病 AUR-101 临床Ⅱ期 Dr. Reddy's Lab 银屑病 SAR-441169 临床Ⅰ期 Lead Pharma 银屑病 3. 临床终止或无进展的RORγt反向激动剂
除了上述处于临床研究中的RORγt反向激动剂之外，还有很多化合物因各种原因相继在临床研究阶段宣告终止或暂停研发。JTE-151是由日本烟草公司（Japan Tobacco）研发的RORγt抑制剂（图4）。该化合物早在2013年8月开始Ⅰ期临床试验，用于治疗超敏反应和自身免疫性疾病，2016年宣布Ⅰ期临床终止。随后将JTE-451推向临床，于2020完成了银屑病的Ⅱ期临床研究，但至今未公布任何进展。JTE-761继而进入Ⅰ期临床，但迄今为止尚无任何研究进展被披露。ESR-114（Escalier Biosciences）从2018年8月开始，以外用凝胶形式在患者中开展Ⅰ/Ⅱa期临床试验，并于2019年6月完成试验，但至今未更新进展[26]。
由葛兰素史克公司研发的GSK 2981278通过局部用药治疗银屑病（图4）。尽管其具有很好的临床前效果，但15名患者经19 d Ⅰ期治疗后未显示出疗效。推测可能是由于靶部位的药物暴露量不足，治疗区域太小，或者通常需要全身性抑制等。因此，GSK 2981278的Ⅰ期临床试验已终止。阿斯利康研发的化合物AZD-0284在Ⅰa期单剂量递增（SAD）和多剂量递增（MAD）研究中，实现了高度的RORγ全身抑制。该药耐受性良好，无安全性问题，支持进一步的临床开发。然而，斑块型银屑病患者（NCT03310320）为期4周的Ⅰb期研究于2018年4月暂停。PF-06763809是由辉瑞与Karo Bio合作研发的RORγt反向激动剂。局部应用PF-06763809的Ⅰ期研究于2019年3月完成，共有17名参与者。结果发现该药在银屑病患者中具有良好的耐受性和可接受的安全性，但没有减少皮肤浸润厚度或疾病的生物标志物。之后，该化合物没有再公布任何临床研究进展。
VTP-43742（vimirogant）在体外RORγ结合实验（RORγ IC50 = 3.7 nmol/L）和细胞实验（Gal4 IC50 = 17 nmol/L）中表现出有效抑制作用，对其他ROR亚型的选择性超过1000倍[27]。15 mg/kg（b.i.d, po）给药时对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型有效。然而，该分子具有高亲脂性（logD为7.4 ，大于 4），低溶解度（17 µmol/L）和高人血浆蛋白结合率（游离物仅0.5%）的缺点。针对银屑病患者的Ⅱa期临床试验显示，治疗4周后，该化合物相比于安慰剂组可以减轻银屑病严重程度指数（PASI）。然而，在治疗过程中观察到，700 mg给药剂量组的患者肝酶水平升高，预示VTP-43742存在安全隐患。果不其然，在银屑病患者体内持续16周给药，最终因安全性问题宣布终止Ⅱ期临床研究。艾伯维公司（AbbVie）推上临床的第1个RORγt反向激动剂ABBV-553也由于安全性问题于2017年8月终止。后续的ABBV-157（cedirogant）在2021年4月完成了为期28 d的斑块型银屑病的Ⅰb期临床试验。同年9月开展Ⅱ期临床研究，但根据一项非临床毒理学研究结果，于2022年10月宣布终止了该化合物的后续临床研究。由Reata制药公司开发的RTA-1701是唯一曾进入Ⅰ期临床试验的RORγt变构反向激动剂，用于治疗自身免疫性和炎症性疾病，在类风湿性关节炎和多发性硬化症动物模型中显示出显著的疗效[28]。在2019年6月完成Ⅰ期临床试验后，未公布任何临床研究进展。
4. 处于临床前研究阶段的RORγt反向激动剂
鉴于 RORγt 在 Th17 细胞分化中的关键作用，RORγt 被认为是 IL-17 介导的自身免疫性疾病潜在的治疗靶点，其小分子抑制剂最近几年已成为学术界乃至国际制药公司研究的热点领域。尽管部分候选化合物终止于临床研究的各个阶段，依然有很多制药公司和研究组对该靶标进行大量的研究工作。目前针对该靶标的抑制剂的开发主要包括正构位点反向激动剂和变构位点反向激动剂。
4.1 正构位点反向激动剂
正构位点是由螺旋H3、H5、H6、H7、H11和H12组成，之所以被称为正构位点，是因为其也是内源性配体的结合位点。天然产物地高辛和熊果酸是最初文献报道的RORγt的选择性抑制剂，腹腔给药可以改善小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。随后，越来越多的具有不同骨架结构的小分子RORγt反向激动剂被发现。
4.1.1 芳基酰胺类
2014年，GSK公司通过高通量筛选得到了具有噻唑胺母核的化合物4（图5）。随后通过对化合物4中噻唑环上的两个取代基以及右侧极性片段的构效关系研究，发现了具有高活性的噻唑酮酰胺4a[荧光共振能量转移(FRET) pIC50 = 7.8; Th17 pIC50 = 6.7]和噻吩酮酰胺4b（FRET pIC50 = 7.9; Th17 pIC50 = 7.8）[29]。化合物4a经口给药可以明显改善小鼠EAE模型和CIA模型的疾病症状。在此基础上，进一步优化发现了化合物4c，其同样表现出优异的RORγt和Th17细胞分化的抑制活性。同时，该化合物具有良好的小鼠肝微粒体稳定性，清除率小于0.36 mL/(min·g)[30]。
虽然上述化合物具有很好的RORγt体外活性，但是由于其结构中的噻唑/噻吩酮结构，导致了它们的口服生物利用度和中枢神经系统（CNS）渗透性较差，进而限制了它们经口治疗多发性硬化症（MS）的药物开发。因此，将化合物1结构中的噻唑母核替换为苯环，得到了联芳基酰胺类化合物5，RORγt抑制活性提高了一个数量级，并且药物血脑比（Br/Bl）达到了2倍。通过对化合物5母核中两个苯环的结构修饰以及右侧苯磺酰基片段的优化得到了化合物5a和5b，二者表现出相似的RORγt活性和CNS渗透性。化合物5b的口服生物利用度达到了100%，经口给药后可以剂量依赖性地改善EAE小鼠的临床指标[31]。而化合物5a由于其更出色的体外活性，用作RORγt生物学研究的工具化合物[32]。基于化合物5a，本课题组通过对其中间连接基因（linker）部分，右侧片段和左边片段进行优化，得到化合物6。该化合物表现出有效的RORγt抑制活性（FRET IC50 = 63.8 nmol/L；Gal4 IC50 = 85 nmol/L)。此外，相比于先导化合物5a，化合物6的溶解度有显著提升（100 μg/mL vs 1.25 μg/mL），在小鼠银屑病模型上表现出体内药效[33]。利用化合物5a与Takeda专利的化合物（专利中实施例14）拼合[34]，得到了化合物7a，其表现出中等的抑制活性。进一步对该化合物进行构效关系研究，发现了活性提高的化合物7b，在FRET实验和小鼠Th17细胞分化实验中均具有良好的RORγt抑制活性，并且在小鼠肝微粒体中具有一定的代谢稳定性[35]。
GSK公司通过对噻唑化合物4进行系统的结构优化，发现了新骨架类型的叔胺类RORγt反向激动剂8a，其体外抑制FRET的IC50为25 nmol/L，明显优于化合物4，同时可以抑制Th17细胞的分化（IC50 = 320 nmol/L）[36]（图6）。进一步，对化合物8a的含氨基的linker进行SAR研究，得到化合物8b，其活性与化合物8a相近。使用刚性的吲哚环代替8b中的苯胺基团，得到化合物8c，其FRET和Th17分化抑制活性相较于化合物8a均有明显提升。说明相比于苯环，吲哚环能更有效地破坏AF2结构域。其中，4-卤代苯环和双卤代苯环取代的化合物活性最高，化合物8d抑制FRET的IC50为6 nmol/L，抑制Th17细胞分化的IC50达到9 nmol/L，相比于化合物8a的活性提高了超过30倍。
同时，在化合物4的优化过程中意外发现了联芳基酰胺类化合物9，其表现为RORγt激动活性[37]。共晶结构（PDB: 5YP6）分析化合物的结合模式发现，结构中的砜基可以与Leu287和Arg367形成氢键作用，酰胺linker的NH与Phe377形成氢键，而羰基则通过水分子与His323形成氢键作用网络，同时结构中的3个苯环可以与Phe377、Phe378、Phe388形成π-π堆积作用。结构中的异丁基位于靠近AF2的疏水口袋，起到了稳定AF2的作用，从而发挥激动活性。对化合物9进行结构改造，发现的化合物9a由激动剂变成了“短”反向激动剂，而化合物9b由激动剂变成了“长”反向激动剂。这一研究表明，通过调整化合物在AF2口袋附近的官能团大小，可以实现激动剂和反向激动剂的功能转换，这为RORγt调节剂的发现提供了参考。
4.1.2 喹啉、喹唑啉酮和四氢异喹啉类
化合物10是Janssen制药公司通过高通量筛选得到的具有RORγt抑制活性的苗头化合物，热荧光法Kd为160 nmol/L[38]（图7）。随后，为建立喹啉类母核化合物的SAR，对其C-2、C-3、C-4、C-6位进行了系统的结构修饰[38−40]。首先针对C-2和C-4位的SAR研究结果表明，保留C-4上的氯原子，用吸电子基团（如三氟甲基）或给电子基团（如甲氧基或二甲氨基）替代C-2上的氯原子，可以提高其完全反向激动活性。由此发现了消旋化合物10a，其Kd为2 nmol/L，相较于化合物10活性提高了80倍[38]。进一步研究喹啉母核的C-3取代基，发现含有4-(甲基磺酰基)苯基的化合物10b显示出良好的结合亲和力（Kd = 37 nmol/L）。为了增加与LBD的H10-H12之间的相互作用，在喹啉母核C-3位苄基的对位引入吡唑-1-基，得到的化合物10c在RORγt细胞实验中表现为有效的反向激动活性，IC50为73 nmol/L[38]。当化合物10c的4-（吡唑-1-基）苄基替换为饱和的4-三氟甲基哌啶-1-甲基时，所得化合物10d的结合亲和力和RORγt反向激动活性显著提高，IC50分别达到0.3 nmol/L和12 nmol/L [40]。对于C-6位的结构修饰发现，将咪唑环替换为1-乙酰基-4-哌啶基后，所得化合物10e的RORγt反向激动活性相较于化合物10c也有一定的提高[39]。
除了喹啉系列外，喹唑啉酮、四氢喹啉以及四氢异喹啉类RORγt反向激动剂也有报道。化合物11a属于喹唑啉酮类RORγt反向激动剂[41]（图8）。该化合物的体外活性优异，口服给药可以降低EAE大鼠模型中淋巴结IL-17a mRNA的表达水平。基于该化合物进行构象限制及结构优化，得到抑制活性保持的化合物11b（R构型）[42]。相比于化合物11a，11b经1 mg/kg灌胃给药后大鼠体内的暴露量提高10倍以上，达到了1289 ng·h/mL。30 mg/kg灌胃给药后可显著降低IL-17a mRNA的表达水平（相比于对照组降低59%）。化合物12a属于四氢异喹啉类衍生物，其具有优异的RORγt反向激动活性和良好PK性质[43]。在IL-23诱导的基因表达实验中，灌胃给药后可剂量依赖性地抑制IL-17A的产生。为降低化合物12a的LogD，替换掉结构中的三甲基硅基，再经优化得到的化合物12b，表现出提高的体外RORγt抑制活性和PK性质，可有效改善小鼠EAE模型的临床症状[44]。化合物13是本课题组发现的四氢喹啉类RORγt反向激动剂，其抑制RORγt的IC50为31.5 nmol/L [45]。化合物14是复旦大学付伟教授课题组发现的一类N-磺酰胺四氢喹啉类RORγt反向激动剂[46]。虽然该化合物的体外抑制活性不强，但在IMQ诱导的小鼠银屑病模型上具有体内药效和安全性。
4.1.3 三环类
化合物15是百时美施贵宝（BMS）发现的先导化合物，其口服生物利用度达到100%，并在IL-23诱导的棘皮炎小鼠模型上表现出优异的药效，但缺点是其RORγt抑制活性偏弱，RORγt Gal4 IC50为119 nmol/L [47]（图9）。利用构象限制策略，得到了三环类化合物15a，其不仅在RORγt Gal4 和IL-17 hWB实验中体现出很好的活性，IC50分别为7 nmol/L和19 nmol/L，同时其在多个种属的肝微粒体中的代谢稳定性均大于120 min[48]。进一步对羧酸部分进行优化，得到的化合物15b具有与化合物15a相似的体外活性、代谢稳定性及更优异的PK性质，在IL-23诱导的银屑病模型上具有优异的体内药效。对化合物15b进行改造，得到化合物15c，其活性和代谢稳定性基本保持[49]。通过对化合物15a的结构优化，得到了BMS公司的第1个RORγt反向激动剂类临床候药物BMS-986251（15d），化合物15d在小鼠自身免疫性疾病模型（如IL-23诱导的棘皮炎和IMQ诱导的银屑病模型）上均体现出显著体内药效[50]。
通过对BMS-986251进行构效关系研究，得到的化合物15e是一个有效的、选择性的RORγt反向激动剂，但该化合物水溶性较差[51]。为改善水溶性，通过侧链中的羟基，制备了化合物15e的磷酸盐前药。该前药具有良好的溶解性和体内暴露量，并在小鼠银屑病模型中表现出显著的疗效。BMS-986313（15f）作为BMS-986251的衍生物，在小鼠自身免疫性疾病模型上表现出与化合物15d相当的体内药效[52]。
4.1.4 磺酰胺类
化合物16是通过高通量筛选得到的RORγ反向激动剂，分子中含有磺酰胺结构。该化合物在RORγ放射性结合实验（监测[3H2]25-羟基胆固醇）和RORγ SRC-1测试实验中的IC50分别为370和360 nmol/L，具有一定的RORγ抑制活性，但该化合物对LXR有激动作用[53]。通过对该化合物的噻吩环和磺酰氨基部分进行结构优化，得到化合物16a和16b，二者的RORγ抑制活性均得到显著提高（图10）。化合物16a对LXR仅有5倍选择性（RORγ Gal4 IC50 = 0.45 μmol/L vs LXR Gal4 IC50 = 2.3 μmol/L），化合物16b的选择性更好，其抑制LXR的IC50大于10 μmol/L[53]。将化合物16a结构中的磺酰胺基进行“倒置”，得到化合物16e，其抑制RORγ的IC50为160 nmol/L。对化合物16e进行结构优化，得到体外活性显著提高的化合物16f，其抑制Gal4细胞的IC50达到7 nmol/L [54]。
与此同时，为了降低该系列化合物的亲脂性，提高化合物的溶解性，利用生物电子等排原理将化合物16a的联芳基末端苯环替换为哌嗪环，得到化合物16c[55]，其抑制RORγ SRC1的IC50与化合物16a相当，但完全丧失对LXR受体的结合活性。在pH 7.4的条件下，化合物16c的水溶性达到了37 μmol/L（pH 7.4），远高于化合物16a（同等条件下溶解度小于1 μmol/L）。但该化合物在大鼠和人肝微粒体上的清除率很高，原因是环丁基容易脱除，哌嗪环容易被氧化。基于MetID数据，为改变环丁基结构，设计了系列环磺酰胺类化合物[56]。其中化合物16d在蛋白水平和细胞水平的活性均优于化合物16c，相较于ROR家族对RORγ有大于75倍的选择性，相比于其他核受体家族有大于200倍的选择性。该化合物也表现出良好的体外ADME和体内PK性质，口服生物利用度达到55%，并能剂量依赖性地抑制小鼠体内IL-17的生成[56]。
除上述几个大类外，还有苯基吡咯烷类[57−58]、噻唑双酰胺类[59]、二氢茚环酰胺类[60]、三嗪类[61]等（图11）。
4.2 变构位点反向激动剂
RORγt变构位点是近年来才发现的结合位点，由螺旋H3、H4、H5、H11和H12组成，该位点比正构位点小，但是更靠近H12。迄今为止，大部分临床研究的 RORγt 反向激动剂都与正构位点结合，通过变构结合模式起作用的反向激动剂较少。2015年，Scheepstra等[62]首次发现酰基吲唑类 RORγt反向激动剂MRL-871（22，图12）, 通过作用在RORγt-LBD的变构结合口袋发挥作用，且其抑制RORγt的IC50达到7 nmol/L。化合物 MRL-871主要通过氢键作用和疏水作用与变构口袋结合，羧酸部分与Ala497和Phe498（H12）的主链酰胺及Gln329的侧链（H3）之间产生关键的氢键作用，直接破坏了His479和Tyr 502之间的氢键网络，同时2,6-二取代基使苯环位置偏移与 Phe506 形成 π-π 堆积作用。随着第一类RORγt变构反向激动剂的发现，许多公司和研究小组对这些化合物进行了后续研究，发现系列RORγt变构反向激动剂[63]。按母核结构类型可将其分为吲唑及其衍生物类、异噁唑类及三环嘧啶类。
4.2.1 吲唑及其衍生物类
Genentech公司围绕MRL-871系列化合物进行了广泛的构效关系研究[64]（图12）。研究发现MRL-871虽然对RORγt的抑制活性很强，但对于PPARγ的亲和力也较强（EC50 = 130 nmol/L），为提高化合物对RORγt的选择性，通过骨架跃迁，得到化合物22a（GNE-0946）。化合物22a具有优异的RORγt抑制活性（RORγt Gal4 IC50 = 4 nmol/L; IL-17 PBMC IC50 = 17 nmol/L），对RORγ的选择性比其他ROR家族成员、PPARγ和NR高300倍以上，同时其在大鼠体内的口服生物利用度达到40%。
Glenmark公司以MRL-871为先导化合物，通过骨架跃迁，发现具有噻吩并吡唑类化合物22b，相较于MRL-871表现出显著降低的体外RORγt抑制活性（FRET IC50 = 425 nmol/L）。解析化合物-蛋白晶体复合物结构发现，该化合物与MRL-871具有类似的结合模式，保留了相同的氢键作用，不同的是噻吩环的甲基取代基使得化合物朝向H4的空间位阻增大[65]。这一结果表明，增大H4附近的位阻不利于提高化合物对RORγt的亲和力。
Galderma R&D公司通过改变MRL-871结构中杂环酰胺的linker，发现了一系列新的RORγt变构抑制剂，期望改善MRL系列化合物的代谢稳定性[66]。化合物22c表现出优异的RORγt抑制活性（RORγt Gal4 IC50 = 31 nmol/L）和选择性。通过共晶结构（PDB: 5LWP）分析其结合模式发现，羧基与Ala497、Phe498和Gln329产生关键的氢键作用，这一点与MRL-871的结合模式一致。此外，二甲氨基甲酰基中的羰基可以与Met358的NH形成氢键（图13）。尽管该化合物与RORγt蛋白口袋形成的氢键更多，但这一优势并没有体现在活性的提高上，这同样意味着朝向H4的大空间位阻不利于活性。
化合物22d（RORγt Gal4 IC50 = 12 nmol/L）含有吲哚母核[67]，化合物22e（RORγt Gal4 IC50 = 49 nmol/L）吲唑的3位取代基为哌啶环[68]。通过分析该系列化合物的构效关系可知，结构中的羧基对于活性的维持至关重要，2,6-双取代基有利于活性的提升，吲唑中芳基上的取代基（朝向H4）不利于提高化合物对RORγt的亲和力。
4.2.2 异噁唑类
Meijer等[69]于2020年报道了系列异噁唑类RORγt变构反向激动剂（图14）。基于MRL-871结构，通过in silico药效团筛选方法及基于结构的药物化学优化手段，发现了化合物23，其体外活性为264 nmol/L。共晶结构发现该化合物与MRL-871结合位点相同，差别在于吡咯环的NH可以与Leu353和Lys354残基的羰基形成氢键，但是同样由于吡咯环朝向H4的空间位阻导致该化合物的RORγt抑制活性远低于MRL-871。随后，该课题组对化合物23进行了SAR研究，侧重于对C-4位的linker和C-5位取代基的优化[70]。对于C-4位，含醚键连接臂的化合物23a和含反式烯烃连接臂的化合物23b的活性明显得到提升，IC50分别为（31 ± 3）nmol/L和（20 ± 2）nmol/L。对于C-5位，含有吡咯-2-基的化合物23c的活性降低，IC50为（140 ± 10）nmol/L，但其通过RORγt口袋中的水分子形成另一氢键相互作用网络。值得一提的是，含有吡唑-3-基的化合物23d相比于23a表现出良好的Ⅰ相代谢稳定性[CLint: 8.8 μL/（min·mg） vs 57.8 μL/（min·mg）]和血浆稳定性（100% vs 74.2%）。
4.2.3 三环嘧啶类
Reata制药公司披露了一系列具有三环嘧啶结构的RORγt反向激动剂[71]（图15）。利用RORγt Gal4报告基因检测方法筛选该公司的化合物库，发现具有中等RORγt抑制活性的三环嘧啶类化合物24 (IC50 = 603 nmol/L)。随后的构效关系研究发现化合物24a和24b具有良好的体外活性，它们抑制RORγt Gal4的IC50分别为58和82 nmol/L，在人CD4+ T细胞IL-17A表型实验中的IC50分别为40和12 nmol/L。此外，它们对RORα和RORβ以及其他NR家族表现出良好的ROR亚型选择性。化合物24a能有效抑制Th17分化（IC50 = 28 nmol/L），并显著降低Th17关键特征基因IL-17A, IL-17F, IL-26和C-C基序趋化因子配体20 (CCL20)的表达。尤为重要的是，在小鼠胶原诱导的类风湿性关节炎模型上，化合物24a通过灌胃给药后（3 mg/kg）相比于对照组表现出显著的药效。
进一步SAR研究表明，Michael受体对生物活性至关重要[71]。当Michael受体中的双键替换为单键时，所有类似物的活性均显著降低。通过氨基酸位点定向诱变和分子动力学模拟研究发现，该类化合物的结合位点与之前描述的RORγt变构位点不同，其特异性地与RORγt-LBD的H11上Cys476发生共价结合。
5. 总结与展望
Th17细胞及其分泌的炎性因子IL-17对慢性炎症和自身免疫性疾病的发生发展至关重要。而RORγt作为 Th17 细胞的重要转录因子，能够促使Th17细胞分化并分泌IL-17。因此，针对自身免疫性疾病的RORγt反向激动剂的研发受到了越来越多的关注。随着第1个RORγ反向激动剂T0901317的发现，许多不同骨架类型的RORγt反向激动剂应运而生并推向临床，包括正构位点反向激动剂和变构位点反向激动剂。
然而，迄今为止，RORγt反向激动剂尚未得到广泛的临床应用，大多数临床化合物因疗效差或安全性问题被迫终止临床试验。例如，在RORγt反向激动剂的结构优化中，发现其可能激活孕烷X受体（PXR）导致细胞色素P450酶的自诱导，从而降低化合物在体内的暴露量和药效。另外，部分RORγt反向激动剂表现出潜在的胸腺副作用，如胸腺淋巴细胞增多、胸腺淋巴瘤和胸腺畸变。因此，为了获得安全有效的RORγt反向激动剂，后续的研发方向应该集中在提高疗效和选择性或降低毒性上。
同时，之前大多数RORγt反向激动剂的临床适应证主要集中在银屑病，因此研究RORγt对IL-17介导的炎症的影响，探索RORγt反向激动剂在更多炎性疾病中的应用可能是未来发展的另一个方向。
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