2018年 第49卷 第2期
2018, 49(2): 129-135.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180201
摘要：
微生物次级代谢产物结构多样、种类丰富，是新药发现的重要来源。微生物次级代谢产物由特定生物合成基因簇编码合成，通常与微生物的生长繁殖无关。由于实验室可培养微生物的数量较少，而且多数可培养微生物存在基因簇沉默的现象，严重阻碍了微生物来源药物的研究和开发。微生物生物合成基因簇的异源表达及生物合成相应的次级代谢产物已逐渐成为发现新颖活性化合物的有效手段之一。作为研究微生物次级代谢产物的重要工具，基于TAR(transformation associated recombination)克隆技术的异源表达策略可实现绝大多数基因簇的完整异源表达。本文从TAR克隆技术的原理、应用和策略改进3个方面，总结了基于TAR克隆技术的微生物次级代谢产物异源生物合成的研究进展，为研究和开发新型微生物来源药物提供方法学借鉴。
微生物次级代谢产物结构多样、种类丰富，是新药发现的重要来源。微生物次级代谢产物由特定生物合成基因簇编码合成，通常与微生物的生长繁殖无关。由于实验室可培养微生物的数量较少，而且多数可培养微生物存在基因簇沉默的现象，严重阻碍了微生物来源药物的研究和开发。微生物生物合成基因簇的异源表达及生物合成相应的次级代谢产物已逐渐成为发现新颖活性化合物的有效手段之一。作为研究微生物次级代谢产物的重要工具，基于TAR(transformation associated recombination)克隆技术的异源表达策略可实现绝大多数基因簇的完整异源表达。本文从TAR克隆技术的原理、应用和策略改进3个方面，总结了基于TAR克隆技术的微生物次级代谢产物异源生物合成的研究进展，为研究和开发新型微生物来源药物提供方法学借鉴。
2018, 49(2): 136-146.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180202
摘要：
富勒烯是一种有效的自由基清除剂和抗氧化剂，对富勒烯进行化学修饰得到的富勒烯衍生物具有良好的水溶性及生物活性。富勒烯及其衍生物具有抗氧化、细胞保护、抗微生物、光动力、载带药物和肿瘤治疗等多种活性，在医药领域发挥着重要作用，近几年这方面的研究又取得了较大进展。本文从调控肿瘤微环境、应用于药物载体和光动力疗法、抗氧化应激4个方面综述了富勒烯及其衍生物在医药领域的最新应用研究进展，并对其在医药领域的未来发展及应用进行展望。
富勒烯是一种有效的自由基清除剂和抗氧化剂，对富勒烯进行化学修饰得到的富勒烯衍生物具有良好的水溶性及生物活性。富勒烯及其衍生物具有抗氧化、细胞保护、抗微生物、光动力、载带药物和肿瘤治疗等多种活性，在医药领域发挥着重要作用，近几年这方面的研究又取得了较大进展。本文从调控肿瘤微环境、应用于药物载体和光动力疗法、抗氧化应激4个方面综述了富勒烯及其衍生物在医药领域的最新应用研究进展，并对其在医药领域的未来发展及应用进行展望。
2018, 49(2): 147-157.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180203
摘要：
激酶活性异常或过度表达与包括肝纤维化在内的多种疾病的发生密切相关，已成为治疗这些疾病的重要药物靶点。蛋白激酶中的酪氨酸激酶和丝/苏氨酸以及脂类激酶中的磷脂酰肌醇-3激酶等能够通过调节肝星状细胞的活性及肝内血管生成等直接或间接机制参与肝纤维化的发生和发展。近期研究表明，小分子激酶抑制剂能够通过靶向激酶抑制细胞增殖以及血管生成从而发挥抗肝纤维化作用，有望为肝纤维化治疗提供一种新的治疗手段。本文对酪氨酸激酶、丝/苏氨酸激酶和磷脂酰肌醇-3激酶在肝纤维化中的作用和其参与调节肝纤维化发生发展的细胞信号通路，以及小分子激酶抑制剂在肝纤维化临床前动物模型和临床试验中的最新研究进展进行综述，为肝纤维化的治疗研究提供新的策略。
激酶活性异常或过度表达与包括肝纤维化在内的多种疾病的发生密切相关，已成为治疗这些疾病的重要药物靶点。蛋白激酶中的酪氨酸激酶和丝/苏氨酸以及脂类激酶中的磷脂酰肌醇-3激酶等能够通过调节肝星状细胞的活性及肝内血管生成等直接或间接机制参与肝纤维化的发生和发展。近期研究表明，小分子激酶抑制剂能够通过靶向激酶抑制细胞增殖以及血管生成从而发挥抗肝纤维化作用，有望为肝纤维化治疗提供一种新的治疗手段。本文对酪氨酸激酶、丝/苏氨酸激酶和磷脂酰肌醇-3激酶在肝纤维化中的作用和其参与调节肝纤维化发生发展的细胞信号通路，以及小分子激酶抑制剂在肝纤维化临床前动物模型和临床试验中的最新研究进展进行综述，为肝纤维化的治疗研究提供新的策略。
2018, 49(2): 158-164.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180204
摘要：
1型糖尿病(T1DM)是由抗原特异性T淋巴细胞对β细胞靶向破坏，引起胰岛素绝对缺乏而导致的自身免疫性疾病，患者需终身进行胰岛素治疗，其发病机制尚不完全清楚，但多项数据显示感染性疾病发病率的下降伴随着过敏和自身免疫疾病发病率的上升，因而推测环境因素在T1DM的发生中起到重要作用。现已有多种细菌、寄生虫、病毒及其成分在动物模型中被证明可以预防T1DM，因此，通过微生物疫苗进行早期免疫刺激，进而诱导自身免疫耐受，有望成为预防T1DM安全有效的新方法。本文对临床和动物研究中的1型糖尿病微生物疫苗进行综述，主要从微生物的灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗和活载体疫苗进行概述，并讨论了各类疫苗可能的作用机制。
1型糖尿病(T1DM)是由抗原特异性T淋巴细胞对β细胞靶向破坏，引起胰岛素绝对缺乏而导致的自身免疫性疾病，患者需终身进行胰岛素治疗，其发病机制尚不完全清楚，但多项数据显示感染性疾病发病率的下降伴随着过敏和自身免疫疾病发病率的上升，因而推测环境因素在T1DM的发生中起到重要作用。现已有多种细菌、寄生虫、病毒及其成分在动物模型中被证明可以预防T1DM，因此，通过微生物疫苗进行早期免疫刺激，进而诱导自身免疫耐受，有望成为预防T1DM安全有效的新方法。本文对临床和动物研究中的1型糖尿病微生物疫苗进行综述，主要从微生物的灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗和活载体疫苗进行概述，并讨论了各类疫苗可能的作用机制。
2018, 49(2): 165-172.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180205
摘要：
碳纳米管以其管状结构所具有的高载药量、易穿透细胞膜等特性成为了许多抗肿瘤药物和基因的优良载体，且随着对碳纳米管研究的逐渐深入，其在肿瘤光热治疗和肿瘤诊断方面的应用也成为了目前的研究热点。然而碳纳米管固有的化学惰性、易聚集等特性限制了其在临床上的应用，为克服其缺陷，研究者通常会先对碳纳米管进行功能化，再对功能化碳纳米管进行一系列的研究。本文对功能化碳纳米管在肿瘤化疗和基因治疗、肿瘤光热治疗以及肿瘤诊断方面的应用进行了总结。
碳纳米管以其管状结构所具有的高载药量、易穿透细胞膜等特性成为了许多抗肿瘤药物和基因的优良载体，且随着对碳纳米管研究的逐渐深入，其在肿瘤光热治疗和肿瘤诊断方面的应用也成为了目前的研究热点。然而碳纳米管固有的化学惰性、易聚集等特性限制了其在临床上的应用，为克服其缺陷，研究者通常会先对碳纳米管进行功能化，再对功能化碳纳米管进行一系列的研究。本文对功能化碳纳米管在肿瘤化疗和基因治疗、肿瘤光热治疗以及肿瘤诊断方面的应用进行了总结。
2018, 49(2): 173-180.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180206
摘要：
溶致液晶是由两亲性分子溶解在极性溶剂中形成的具有特殊几何结构的体系，根据结构的不同，可分为层状液晶、立方相液晶及六角相液晶。近年来，溶致液晶已应用于药物传递领域，尤其是在经皮和黏膜给药系统上表现出独特的优势，如高生物黏附性、高透皮渗透性、低流动性、缓慢释药等。笔者结合所在课题组对溶致液晶在鼻腔给药、经皮给药的研究和相关文献，探讨并分析溶致液晶用于经皮及黏膜给药的技术策略，着重探讨了在鼻腔黏膜给药领域的研究策略，最终为溶致液晶在经皮及黏膜给药制剂的进一步研究提供理论基础和研究方向。
溶致液晶是由两亲性分子溶解在极性溶剂中形成的具有特殊几何结构的体系，根据结构的不同，可分为层状液晶、立方相液晶及六角相液晶。近年来，溶致液晶已应用于药物传递领域，尤其是在经皮和黏膜给药系统上表现出独特的优势，如高生物黏附性、高透皮渗透性、低流动性、缓慢释药等。笔者结合所在课题组对溶致液晶在鼻腔给药、经皮给药的研究和相关文献，探讨并分析溶致液晶用于经皮及黏膜给药的技术策略，着重探讨了在鼻腔黏膜给药领域的研究策略，最终为溶致液晶在经皮及黏膜给药制剂的进一步研究提供理论基础和研究方向。
2018, 49(2): 181-186.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180207
摘要：
设计完成了环酯肽类活性天然产物Hikiamides A - C 的全合成:以市售氮端或羧基端保护的氨基酸为原料，采用片段汇聚式的液相缩合方法。首先，分别制备三肽片段(化合物 5a / 5b )和二肽片段(化合物 8a / 8b )；然后，经过缩合、催化氢化得到直链五肽(化合物 9a / 9b / 9c )；最后，在混合缩合剂(PyBOP和HBTU)的作用下，关环得到Hikiamides A - C ，总收率分别为9%、11%和6.5%。该液相全合成方法具有经济性强、操作简便，收率高等优点，有效解决了Hikiamides A - C 天然来源获得性较差的问题。
设计完成了环酯肽类活性天然产物Hikiamides A - C 的全合成:以市售氮端或羧基端保护的氨基酸为原料，采用片段汇聚式的液相缩合方法。首先，分别制备三肽片段(化合物 5a / 5b )和二肽片段(化合物 8a / 8b )；然后，经过缩合、催化氢化得到直链五肽(化合物 9a / 9b / 9c )；最后，在混合缩合剂(PyBOP和HBTU)的作用下，关环得到Hikiamides A - C ，总收率分别为9%、11%和6.5%。该液相全合成方法具有经济性强、操作简便，收率高等优点，有效解决了Hikiamides A - C 天然来源获得性较差的问题。
2018, 49(2): 187-194.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180208
摘要：
采用热熔挤出(HME)技术制备难溶性药物伊曲康唑(ITZ)无定型固体分散体并和原研药(RLD)作比较，为进一步的制剂研究提供基础。根据药物和载体的溶解度参数(δ)，玻璃态转化温度(Tg)，选择Soluplus，Kollidon VA64，HPMCAS和Eudragit EPO 4种载体。利用差示扫描量热法(MT-DSC)进行载体初步筛选，并运用HME技术成功制备基于这4种载体的伊曲康唑无定形固体分散体。通过MT-DSC、偏振光显微镜(PLM)、X射线衍射光谱(XRPD)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)对固体分散体的物理状态进行表征，探究药物与辅料的相互作用以及固体分散体的无定型状态。以体外溶出度和动力学溶解度为指标进一步考察4种载体及30%和50%两种载药量对体外溶出度的影响。结果显示，ITZ与Soluplus(3∶7)混合，在170 ℃下通过HME得到的固体分散体能显著提高溶出度，并且在40 ℃，75% 相对湿度条件下放置30 d未发生重结晶现象。MT-DSC等表征证实ITZ以无定型态与Soluplus达到分子层面互溶可能是其溶出度增加的主要因素。本研究为固体分散体的制备及理论研究提供了基础。
采用热熔挤出(HME)技术制备难溶性药物伊曲康唑(ITZ)无定型固体分散体并和原研药(RLD)作比较，为进一步的制剂研究提供基础。根据药物和载体的溶解度参数(δ)，玻璃态转化温度(Tg)，选择Soluplus，Kollidon VA64，HPMCAS和Eudragit EPO 4种载体。利用差示扫描量热法(MT-DSC)进行载体初步筛选，并运用HME技术成功制备基于这4种载体的伊曲康唑无定形固体分散体。通过MT-DSC、偏振光显微镜(PLM)、X射线衍射光谱(XRPD)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)对固体分散体的物理状态进行表征，探究药物与辅料的相互作用以及固体分散体的无定型状态。以体外溶出度和动力学溶解度为指标进一步考察4种载体及30%和50%两种载药量对体外溶出度的影响。结果显示，ITZ与Soluplus(3∶7)混合，在170 ℃下通过HME得到的固体分散体能显著提高溶出度，并且在40 ℃，75% 相对湿度条件下放置30 d未发生重结晶现象。MT-DSC等表征证实ITZ以无定型态与Soluplus达到分子层面互溶可能是其溶出度增加的主要因素。本研究为固体分散体的制备及理论研究提供了基础。
2018, 49(2): 195-201.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180209
摘要：
本研究建立了基于体外肝微粒体和中药代谢指纹图谱研究六味地黄丸与硝苯地平的药物相互作用的方法。体外肝微粒体温孵采用加入六味地黄丸和硝苯地平置37 ℃水浴中温孵60 min。指纹图谱测定采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%甲酸为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长240 nm；测定温孵前后微粒体中六味地黄丸的代谢指纹图谱，通过相似度比较评价两者的相互作用。结果显示六味地黄丸与硝苯地平共孵前后，代谢指纹图谱无明显差异。在体动物试验显示，六味地黄丸与硝苯地平联合给药前后，典型成分的主要药代动力学参数无显著差异。
本研究建立了基于体外肝微粒体和中药代谢指纹图谱研究六味地黄丸与硝苯地平的药物相互作用的方法。体外肝微粒体温孵采用加入六味地黄丸和硝苯地平置37 ℃水浴中温孵60 min。指纹图谱测定采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%甲酸为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长240 nm；测定温孵前后微粒体中六味地黄丸的代谢指纹图谱，通过相似度比较评价两者的相互作用。结果显示六味地黄丸与硝苯地平共孵前后，代谢指纹图谱无明显差异。在体动物试验显示，六味地黄丸与硝苯地平联合给药前后，典型成分的主要药代动力学参数无显著差异。
2018, 49(2): 202-208.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180210
摘要：
通过建立Caco-2细胞单层模型考察了不同浓度水平的水飞蓟宾和水飞蓟宾葡甲胺的双向跨膜通透性并研究其吸收机制。开发HBSS缓冲液中水飞蓟宾、普萘洛尔和阿替洛尔的LC/MS/MS检测方法，检测实验样品的浓度，并计算表观渗透系数(Papp)。当Caco-2细胞培养到第21天时，对所建立的Caco-2细胞模型进行验证:跨膜电阻值(TEER)大于350 Ω·cm2，荧光黄的Papp远远小于1×10-7 cm/s，阳性对照药阿替洛尔和普萘洛尔的Papp与文献中报道的相近，表明Caco-2细胞单层模型建立成功。3个浓度水平的水飞蓟宾(5，20，50 μg/mL)Papp(AP-BL)均大于2×10-6 cm/s，证明水飞蓟宾的通透性良好。Papp(BL-AP)与Papp(AP-BL)的比值大于2，说明在水飞蓟宾吸收过程中有外排转运体的参与。水飞蓟宾葡甲胺的Papp与水飞蓟宾的基本一致，成盐对于水飞蓟宾的跨膜通透性没有改变。结果表明，水飞蓟宾为跨膜通透性良好药物，其溶解度低，在生物药剂学分类系统(BCS)分类上为Ⅱ类。水飞蓟宾在胃肠道中的释放是其吸收过程的重要影响因素。
通过建立Caco-2细胞单层模型考察了不同浓度水平的水飞蓟宾和水飞蓟宾葡甲胺的双向跨膜通透性并研究其吸收机制。开发HBSS缓冲液中水飞蓟宾、普萘洛尔和阿替洛尔的LC/MS/MS检测方法，检测实验样品的浓度，并计算表观渗透系数(Papp)。当Caco-2细胞培养到第21天时，对所建立的Caco-2细胞模型进行验证:跨膜电阻值(TEER)大于350 Ω·cm2，荧光黄的Papp远远小于1×10-7 cm/s，阳性对照药阿替洛尔和普萘洛尔的Papp与文献中报道的相近，表明Caco-2细胞单层模型建立成功。3个浓度水平的水飞蓟宾(5，20，50 μg/mL)Papp(AP-BL)均大于2×10-6 cm/s，证明水飞蓟宾的通透性良好。Papp(BL-AP)与Papp(AP-BL)的比值大于2，说明在水飞蓟宾吸收过程中有外排转运体的参与。水飞蓟宾葡甲胺的Papp与水飞蓟宾的基本一致，成盐对于水飞蓟宾的跨膜通透性没有改变。结果表明，水飞蓟宾为跨膜通透性良好药物，其溶解度低，在生物药剂学分类系统(BCS)分类上为Ⅱ类。水飞蓟宾在胃肠道中的释放是其吸收过程的重要影响因素。
2018, 49(2): 209-214.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180211
摘要：
建立一种巯基衍生化LC-MS/MS法测定大鼠血浆中内源性谷胱甘肽含量的方法。血浆样品经衍生化处理后采用电喷雾离子源(ESI)-三重四极杆质谱仪于正离子模式下进行选择反应检测(SRM)。色谱柱为Zorbax HILIC PLUS(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流动相为乙腈-水(含0.1%甲酸)(75∶25)；流速为1 mL/min；柱温为35 ℃。甘氨酰酪氨酸作为内标物，4-(N-马来酰亚胺)苯基三甲基碘化铵(MPTA)作为衍生化试剂。方法学验证结果表明:衍生化后的谷胱甘肽在3.000~2 000 ng/mL范围内线性良好，r=0.997 1，最终定量下限约为10 pmol/L。准确度、提取回收率和基质效应均符合生物样本分析的要求。该方法对生物体内谷胱甘肽准确的定量、定性分析，以及其存在状态的正确评价有着重要的临床意义。
建立一种巯基衍生化LC-MS/MS法测定大鼠血浆中内源性谷胱甘肽含量的方法。血浆样品经衍生化处理后采用电喷雾离子源(ESI)-三重四极杆质谱仪于正离子模式下进行选择反应检测(SRM)。色谱柱为Zorbax HILIC PLUS(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流动相为乙腈-水(含0.1%甲酸)(75∶25)；流速为1 mL/min；柱温为35 ℃。甘氨酰酪氨酸作为内标物，4-(N-马来酰亚胺)苯基三甲基碘化铵(MPTA)作为衍生化试剂。方法学验证结果表明:衍生化后的谷胱甘肽在3.000~2 000 ng/mL范围内线性良好，r=0.997 1，最终定量下限约为10 pmol/L。准确度、提取回收率和基质效应均符合生物样本分析的要求。该方法对生物体内谷胱甘肽准确的定量、定性分析，以及其存在状态的正确评价有着重要的临床意义。
2018, 49(2): 215-221.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180212
摘要：
为探究青钱柳三萜酸(TAE)对胰岛素抵抗胰岛α细胞胰高血糖素分泌的影响及其可能的干预机制，采用长期高糖诱导小鼠胰高糖素瘤细胞株(αTC1-6)建立胰岛α细胞胰岛素抵抗细胞模型。实验分组为:正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)，模型组(25 mmol/L葡萄糖)，青钱柳三萜酸组(TAE，1、5、10 μg/mL)，TAE+PI3K抑制剂渥曼青霉素组(10 μg/mL TAE+10 nmol/L wortmannin)。给药后收集上清液，裂解细胞。采用ELISA试剂盒检测αTC1-6细胞上清液的胰高血糖素含量，qPCR和Western blot检测细胞裂解液中的胰岛素受体-1(IRS-1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及其胰岛素信号通路中下游蛋白激B(Akt)的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，TAE可以浓度依赖性降低高糖诱导的αTC1-6细胞的胰高血糖素分泌量，并可增加胞内IRS-1、PI3K和Akt的基因表达和磷酸化水平，而给予渥曼青霉素后能够逆转其作用。研究表明，TAE对高糖所致的胰岛α细胞胰岛素抵抗具有一定的改善作用，并可能与激活IRS/PI3K/Akt信号通路有关。
为探究青钱柳三萜酸(TAE)对胰岛素抵抗胰岛α细胞胰高血糖素分泌的影响及其可能的干预机制，采用长期高糖诱导小鼠胰高糖素瘤细胞株(αTC1-6)建立胰岛α细胞胰岛素抵抗细胞模型。实验分组为:正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)，模型组(25 mmol/L葡萄糖)，青钱柳三萜酸组(TAE，1、5、10 μg/mL)，TAE+PI3K抑制剂渥曼青霉素组(10 μg/mL TAE+10 nmol/L wortmannin)。给药后收集上清液，裂解细胞。采用ELISA试剂盒检测αTC1-6细胞上清液的胰高血糖素含量，qPCR和Western blot检测细胞裂解液中的胰岛素受体-1(IRS-1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及其胰岛素信号通路中下游蛋白激B(Akt)的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，TAE可以浓度依赖性降低高糖诱导的αTC1-6细胞的胰高血糖素分泌量，并可增加胞内IRS-1、PI3K和Akt的基因表达和磷酸化水平，而给予渥曼青霉素后能够逆转其作用。研究表明，TAE对高糖所致的胰岛α细胞胰岛素抵抗具有一定的改善作用，并可能与激活IRS/PI3K/Akt信号通路有关。
2018, 49(2): 222-228.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180213
摘要：
研究肉豆蔻-8散提取物对过氧化氢(H2O2)诱导乳鼠心肌细胞损伤的影响，并探讨其作用机制。分离并培养大鼠乳鼠心肌细胞，建立H2O2诱导心肌细胞损伤模型。倒置显微镜下观察肉豆蔻-8散提取物对心肌细胞形态学的影响；采用MTT法检测心肌细胞活力；使用全自动生化分析仪检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量；采用试剂盒法检测细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)的含量；采用Hoechst荧光细胞核染色观察心肌细胞凋亡形态；使用流式细胞仪测定心肌细胞凋亡率。100 μmol/L H2O2作用2 h能明显造成约50%心肌细胞损伤。H2O2模型组出现细胞间隙增大、细胞数减少、细胞胞浆空泡等明显损伤现象。与H2O2模型组比较，肉豆蔻-8散提取物各剂量组，心肌细胞形态不同程度好转；能明显降低H2O2损伤心肌细胞培养液中LDH、CK、AST含量；显著降低H2O2损伤心肌细胞内MDA和NO含量，并提高SOD活力，能明显抑制H2O2损伤心肌细胞凋亡。通过改善细胞生存状态、提高细胞活力、降低氧化应激损伤、抑制炎症反应、抑制细胞凋亡，肉豆蔻-8散提取物可改善H2O2诱导心肌细胞损伤状态，从而对H2O2损伤的心肌细胞起到保护作用。
研究肉豆蔻-8散提取物对过氧化氢(H2O2)诱导乳鼠心肌细胞损伤的影响，并探讨其作用机制。分离并培养大鼠乳鼠心肌细胞，建立H2O2诱导心肌细胞损伤模型。倒置显微镜下观察肉豆蔻-8散提取物对心肌细胞形态学的影响；采用MTT法检测心肌细胞活力；使用全自动生化分析仪检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量；采用试剂盒法检测细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)的含量；采用Hoechst荧光细胞核染色观察心肌细胞凋亡形态；使用流式细胞仪测定心肌细胞凋亡率。100 μmol/L H2O2作用2 h能明显造成约50%心肌细胞损伤。H2O2模型组出现细胞间隙增大、细胞数减少、细胞胞浆空泡等明显损伤现象。与H2O2模型组比较，肉豆蔻-8散提取物各剂量组，心肌细胞形态不同程度好转；能明显降低H2O2损伤心肌细胞培养液中LDH、CK、AST含量；显著降低H2O2损伤心肌细胞内MDA和NO含量，并提高SOD活力，能明显抑制H2O2损伤心肌细胞凋亡。通过改善细胞生存状态、提高细胞活力、降低氧化应激损伤、抑制炎症反应、抑制细胞凋亡，肉豆蔻-8散提取物可改善H2O2诱导心肌细胞损伤状态，从而对H2O2损伤的心肌细胞起到保护作用。
2018, 49(2): 229-237.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180214
摘要：
PAK1蛋白激酶在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，筛选开发新的PAK1抑制剂作为肿瘤治疗靶向药物具有重要意义。传统的PAK1抑制剂筛选方法存在成本高、效率低等缺陷，而计算机虚拟筛选可降低发现活性先导化合物的成本，提高筛选效率。本实验采用计算机辅助药物虚拟筛选结合Z′lyteTM高通量激酶筛选出1种PAK1靶向候选化合物，体外酶活性检测发现化合物 18 (K788)具有良好的PAK1抑制活性(抑制率为42.7%)。进一步通过MTT检测发现K788具有显著的PAK1阳性肿瘤杀伤活性，抑制活性优于阳性药IPA-3(inhibitor of p21-activated kinase compound-3)。采用流式细胞分析、Western blot检测发现K788能通过抑制PAK1的表达及其活化以激活caspase凋亡通路，诱导结肠癌细胞DLD-1的凋亡。K788具有临床开发应用的潜力，可作为PAK1靶向先导分子进行深入研究。
PAK1蛋白激酶在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，筛选开发新的PAK1抑制剂作为肿瘤治疗靶向药物具有重要意义。传统的PAK1抑制剂筛选方法存在成本高、效率低等缺陷，而计算机虚拟筛选可降低发现活性先导化合物的成本，提高筛选效率。本实验采用计算机辅助药物虚拟筛选结合Z′lyteTM高通量激酶筛选出1种PAK1靶向候选化合物，体外酶活性检测发现化合物 18 (K788)具有良好的PAK1抑制活性(抑制率为42.7%)。进一步通过MTT检测发现K788具有显著的PAK1阳性肿瘤杀伤活性，抑制活性优于阳性药IPA-3(inhibitor of p21-activated kinase compound-3)。采用流式细胞分析、Western blot检测发现K788能通过抑制PAK1的表达及其活化以激活caspase凋亡通路，诱导结肠癌细胞DLD-1的凋亡。K788具有临床开发应用的潜力，可作为PAK1靶向先导分子进行深入研究。
2018, 49(2): 238-246.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180215
摘要：
在两种自身不表达肿瘤相关蛋白AGR2的黑色素瘤细胞A375和B16-F10中加入AGR2以增强肿瘤细胞活性，观察以AGR2为靶点的单克隆抗体18A4对细胞外AGR2诱导的肿瘤细胞活性的抑制作用。用MTT法和克隆形成实验检测AGR2，18A4抗体单用和联合作用对细胞增殖能力的影响；流式细胞术检测AGR2，18A4抗体单用和联合作用对细胞周期的影响；划痕实验检测细胞迁移能力；鬼笔环肽染色检测细胞形态变化；Western blot和免疫荧光染色检测细胞内p53表达量。结果表明，单克隆抗体18A4能够抑制细胞外AGR2诱导的肿瘤细胞增殖速度加快，G1/S细胞周期转化，迁移速度加快和细胞形态的变化。Western blot和免疫荧光染色检测发现在化疗药物阿霉素处理的细胞中，细胞外AGR2降低细胞内p53的表达量，而18A4能够抑制这一现象。实验结果表明18A4能够抑制细胞外AGR2诱导的多种肿瘤细胞活性，是一种潜在的抗肿瘤药物。
在两种自身不表达肿瘤相关蛋白AGR2的黑色素瘤细胞A375和B16-F10中加入AGR2以增强肿瘤细胞活性，观察以AGR2为靶点的单克隆抗体18A4对细胞外AGR2诱导的肿瘤细胞活性的抑制作用。用MTT法和克隆形成实验检测AGR2，18A4抗体单用和联合作用对细胞增殖能力的影响；流式细胞术检测AGR2，18A4抗体单用和联合作用对细胞周期的影响；划痕实验检测细胞迁移能力；鬼笔环肽染色检测细胞形态变化；Western blot和免疫荧光染色检测细胞内p53表达量。结果表明，单克隆抗体18A4能够抑制细胞外AGR2诱导的肿瘤细胞增殖速度加快，G1/S细胞周期转化，迁移速度加快和细胞形态的变化。Western blot和免疫荧光染色检测发现在化疗药物阿霉素处理的细胞中，细胞外AGR2降低细胞内p53的表达量，而18A4能够抑制这一现象。实验结果表明18A4能够抑制细胞外AGR2诱导的多种肿瘤细胞活性，是一种潜在的抗肿瘤药物。
2018, 49(2): 247-252.
DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.20180216
摘要：
为了进一步研究miR-217在小鼠胰腺成体干细胞生长过程中的调控作用，在培养的胰腺成体干细胞中过表达miR-217，用Western blot和免疫荧光的方法检测miR-217对细胞增殖的影响。结果显示，miR-217能够明显抑制胰腺成体干细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和Ki-67的表达。使用生物信息学软件预测miR-217的靶基因，并通过双荧光素酶报告基因的方法验证了miR-217对靶点的靶向性，实验结果表明，miR-217能够抑制PMIR-REPORT-Sirt1-3′UTR荧光素酶活性。进一步在二维培养的胰腺成体干细胞中，过表达miR-217检测Sirt1的表达变化，qPCR和Western blot表明在胰腺成体干细胞中miR-217能够抑制Sirt1的蛋白水平的表达，但对mRNA水平没有影响。在胰腺成体干细胞中分别加入Sirt1的抑制剂尼克酰胺和激动剂白藜芦醇，尼克酰胺能够抑制胰腺成体干细胞的增殖，而白藜芦醇促进了胰腺成体干细胞的增殖。以上结果说明，miR-217通过Sirt1调控胰腺成体干细胞的生长，低表达的miR-217有助于维持胰腺成体干细胞的增殖。
为了进一步研究miR-217在小鼠胰腺成体干细胞生长过程中的调控作用，在培养的胰腺成体干细胞中过表达miR-217，用Western blot和免疫荧光的方法检测miR-217对细胞增殖的影响。结果显示，miR-217能够明显抑制胰腺成体干细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和Ki-67的表达。使用生物信息学软件预测miR-217的靶基因，并通过双荧光素酶报告基因的方法验证了miR-217对靶点的靶向性，实验结果表明，miR-217能够抑制PMIR-REPORT-Sirt1-3′UTR荧光素酶活性。进一步在二维培养的胰腺成体干细胞中，过表达miR-217检测Sirt1的表达变化，qPCR和Western blot表明在胰腺成体干细胞中miR-217能够抑制Sirt1的蛋白水平的表达，但对mRNA水平没有影响。在胰腺成体干细胞中分别加入Sirt1的抑制剂尼克酰胺和激动剂白藜芦醇，尼克酰胺能够抑制胰腺成体干细胞的增殖，而白藜芦醇促进了胰腺成体干细胞的增殖。以上结果说明，miR-217通过Sirt1调控胰腺成体干细胞的生长，低表达的miR-217有助于维持胰腺成体干细胞的增殖。
