Inhibitory effect of IL-27 on the overactivation of microglia
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摘要:
小胶质细胞介导的神经炎症对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发生发展至关重要。通过分析GEO数据库,发现IL-27在AD患者大脑皮质和海马中表达均下降。本研究建立了Aβ1-42损伤BV-2细胞的AD细胞模型、脂多糖(LPS)损伤BV-2细胞的炎症细胞模型和炎症动物模型,给予IL-27以评估其对调节小胶质细胞表型和神经炎症的作用。在动物模型中,通过免疫组化检测海马中Iba1+小胶质细胞数量,通过qPCR、ELISA和Western blot检测TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子表达水平;在细胞模型中,通过qPCR检测小胶质细胞M1/M2表型标志物的表达水平。为进一步探究IL-27的作用机制,通过Western blot检测给予IL-27和Aβ1-42后小胶质细胞中NF-κB、p-NF-κB、IκBα和p-IκBα的表达水平。研究结果表明,IL-27缓解了LPS诱导的脑内小胶质细胞异常激活,降低TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子表达水平;将 LPS或Aβ1-42诱导的小胶质细胞从神经毒性的M1型转化为神经保护的M2型,改善了Aβ1-42诱导的细胞内NF-κB和IκBα的异常磷酸化水平。本研究提示IL-27可调控Aβ1-42或LPS诱导下的小胶质细胞M1/M2极化,进而缓解神经炎症。
Abstract:Neuroinflammation mediated by microglia is essential for the occurrence and development of Alzheimer’s disease (AD). Through the analysis of the GEO database, it was found that IL-27 expression decreased in both the cerebral cortex and hippocampus of AD patients. In this study, the AD cell model of BV-2 cells injured by Aβ1-42, the inflammatory cell model of BV-2 cells damaged by LPS, and the inflammatory animal model were established and the effects of IL-27 after its administration in the above models in regulating microglial phenotype and neuroinflammation were evaluated. In the animal models, the number of Iba1+ microglia in the hippocampus was detected by immunohistochemistry, the expression of pro-inflammatory factors such as TNF-α, IL-1β and IL-6 was detected by qPCR, ELISA and Western blot, and the expression of M1/M2 phenotypic markers in microglia was detected by qPCR. To further explore the action mechanism of IL-27, Western blot was used to detect the expression levels of NF-κB, p-NF-κB, IκBα and p-IκBα in microglia after administration of IL-27 and Aβ1-42. The results showed that IL-27 alleviated the abnormal activation of microglia induced by lipopolysaccharide (LPS), decreased the expression of pro-inflammatory factors such as TNF- α, IL-1β and IL-6, transformed microglia induced by LPS or Aβ1-42 from neurotoxic M1 to neuroprotective M2, and improved the abnormal phosphorylation of NF-κB and IκBα induced by Aβ1-42. The research suggested that IL-27 can regulate the M1/M2 polarization of microglia induced by Aβ1-42 or LPS, and alleviate neuroinflammation.
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Keywords:
- Alzheimer’s disease /
- microglia /
- lipopolysaccharide /
- IL-27 /
- polarization
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骨关节炎(osteoarthritis,OA)又称退行性关节病,是一种以关节软骨的变性、进行性损害以及骨质增生为特征的慢性关节紊乱综合征,常发病于中老年人,主要表现为骨摩擦、晨僵、疼痛和关节运动障碍等,甚至会造成残疾[1−2]。OA可能发生在人体的任何关节上,包括膝关节、髋关节、踝关节、肩关节和肘关节等,但以膝骨关节炎(KOA)最为常见。据估计,全球目前已有3亿人受到OA的影响[3]。OA的发病与年龄、性别、肥胖、工作活动强度、遗传等多种因素有关,其中,高龄和肥胖是主要的致病因素[4−5]。据世界卫生组织(WHO)统计,全球60岁以上人群中约有10%患有OA。目前,我国有约1.33亿人正在遭受着OA的折磨,40岁以上人群患病率达46.3%。随着社会进步和科技发展,人类的生活水平不断提高,但也伴随着人口老龄化程度不断加深,肥胖现象越发普遍,OA的发病率也随之有逐渐上升的趋势,预计到2030年OA将成为世界人口残疾的主要原因[6]。对于患者而言,OA影响了他们的正常生活活动,降低了生活质量,而且他们要面临常年治疗带来的巨大时间成本和经济压力,这同时也增加了医疗系统的负担,也给社会经济造成了巨大的负面影响[4]。根据相关研究,OA对西方国家医疗保健系统造成的经济负担高达国内生产总值的2.5%,预计到2030年,OA对全球经济造成的影响将会成倍增加[7]。因此,探索效果显著的OA治疗方法至关重要。
非甾体抗炎药(NSAIDs)是OA最常用的治疗药物[8],但由于存在全身性风险,如胃肠道疾病、心血管疾病和与之相关的肾功能不全等,不推荐长期口服使用这些药物。外用NSAIDs也可以治疗OA,但这些药物有时不能完全起效,尤其是对于远离体表的髋关节。透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种线性糖胺聚糖,由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖双糖重复单元组成[9]。关节腔内注射HA是一种临床上常用的治疗早期OA的方法,然而其见效缓慢,并且所注射的外源性透明质酸容易被透明质酸酶降解,需要多次注射。由于关节腔内注射HA具有较高的侵袭性,反复的关节腔内注射不仅繁琐而且存在感染风险,同时还存在临床反应不足等问题[10−11]。
双氯芬酸透明质酸钠(diclofenac etalhyaluronate sodium,DF-HA)注射液于2021年3月23日在日本获批上市,用于治疗膝关节和髋关节OA,是一种新型关节腔内注射剂。DF-HA由发酵来源的HA与NSAIDs双氯芬酸(DF)共价连接[12],通过在给药部位关节组织中持续释放DF来提供持续的抗炎镇痛作用。此外,据报道,DF-HA具有比HA更好地产生高分子量HA作用、软骨保护作用和软骨退化抑制作用[13]。本研究参照上述原研药[12]通过化学接枝的方法最终合成了一种DF-HA接枝共聚物,利用核磁共振氢谱(1H NMR)、紫外分光光度计、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪对其进行了结构表征,并利用HPLC对其进行体外释放研究,考察双氯芬酸的释放行为,与参比制剂进行比对。
1. 材 料
1.1 药品与试剂
透明质酸(HA,Mr 800 kD,济南鲁欣化工科技有限公司);双氯芬酸钠(DF-Na,广州顺彤医药化工有限公司);2-溴乙胺氢溴酸盐、二碳酸二叔丁酯[(Boc)2O]、N-羟基琥珀酸酰亚胺(NHS)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);咔唑、D-葡萄糖醛酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(上海麦克林生化科技股份有限公司);双氯芬酸透明质酸钠参比制剂(小野制药工业株式会社);磷酸缓冲盐溶液(PBS,江苏凯基生物技术股份有限公司);甲醇和甲酸为色谱纯,其他试剂均为市售分析纯。
1.2 仪 器
Avance AV-500核磁共振波谱仪、Alpha Ⅱ傅里叶红外光谱仪(德国Bruker有限公司);2450紫外分光光度计、LC-20AT高效液相色谱仪、SPD-20A紫外检测器(日本岛津公司)。
2. 方 法
2.1 DF-HA的合成
2.1.1 Boc-氨基乙基溴化物的合成
将2-溴乙胺氢溴酸盐10.5 mmol溶解于二氯甲烷20 mL,冰浴下加入三乙胺10.5 mmol,二碳酸二叔丁酯10.5 mmol用二氯甲烷5 mL溶解后,加入上述溶液中,室温下搅拌反应90 min,用乙酸乙酯萃取,依次用5%柠檬酸水溶液、水、饱和氯化钠溶液进行分液洗涤,各2次,无水硫酸钠干燥后,减压蒸馏除去溶剂得到淡黄色透明液体,为Boc-氨基乙基溴化物,产率为98%。
2.1.2 Boc-氨基乙醇-双氯芬酸的合成
将Boc-氨基乙基溴化物10.2 mmol溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)5 mL然后进行冰冷却,加入双氯芬酸钠10.2 mmol的DMF溶液6 mL,80 ℃下搅拌反应10 h,再在室温下搅拌12 h。用乙酸乙酯萃取,依次用5%的NaHCO3水溶液、水、饱和氯化钠溶液进行分液洗涤,无水硫酸钠干燥后,减压蒸馏去除溶剂得到粗品,其中含有杂质双氯芬酸。粗品利用硅胶柱色谱(甲苯-乙酸乙酯,20∶1、0.5%三乙胺)纯化,减压蒸馏后得到白色固体,为Boc-氨基乙醇-双氯芬酸,产率为83%。
2.1.3 2-氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐的合成
将Boc-氨基乙醇-双氯芬酸4.8 mmol溶解于二氯甲烷5 mL,冰浴,加入4 mol/L的盐酸-乙酸乙酯溶液30 mL,搅拌2.5 h。加入乙醚、正己烷进行沉淀,抽滤,洗涤除杂质,沉淀物真空干燥2 d后得到白色固体,取少量进行TLC点板,板的原点处有亮紫色斑点,其他位置无杂斑(展开剂为甲苯-乙酸乙酯,5∶1),为2-氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐,产率为86%。
2.1.4 DF-HA的合成
将HA(Mr 800 kD)1.25 mmol溶解于水56.3 mL和二噁烷56.3 mL,室温搅拌1 h以增溶,依次加入NHS和EDC·HCl,室温搅拌30 min,滴加氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐的水/二噁烷溶液,室温搅拌24 h。向反应液中加入5%的NaHCO3水溶液7.5 mL搅拌4 h后,再向反应液中加入50%乙酸水溶液215 μL进行中和,加入氯化钠2.5 g搅拌30 min。加入乙醇400 mL进行沉淀,将沉淀物依次用85%乙醇水溶液、乙醇、乙醚分别洗涤2次后真空干燥得到粗品,粗品用适量水溶解后转移至透析袋(截留分子量
2000 D)中透析共20 h,除去小分子杂质,透析结束后将透析液冷冻干燥得白色蓬松固体,为DF-HA。2.2 DF-HA的表征
2.2.1 1H NMR表征
称取HA、DF-HA 10 mg,溶于D2O 0.55 μL中;称取2-氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐10 mg,溶于CDCl3 0.55 μL中,利用500 MHz核磁共振波谱仪测定样品的核磁氢谱图,并计算接枝率。
2.2.2 紫外分光光度法表征
精密称取HA 10 mg,加水溶解并稀释至50 mL,摇匀,制成200 μg/mL的HA溶液。精密称取双氯芬酸钠对照品10 mg,加水溶解并稀释至50 mL,摇匀,制成200 μg/mL的双氯芬酸钠对照品溶液。精密称取DF-HA 10 mg,加水溶解并稀释至50 mL,摇匀,制成200 μg/mL的DF-HA溶液。分别对HA、DF-Na、DF-HA进行全波长扫描,记录紫外吸收光谱图,并判断DF-Na的特征吸收峰,观察DF-HA在DF-Na特征吸收波长处的吸收情况,由此判断DF-HA是否接枝成功。
采用改良咔唑法[14]通过测定D-葡萄糖醛酸的含量间接确定透明质酸的含量,具体操作如下。
硼砂-硫酸溶液(0.025 mol/L):精密称取十水合四硼酸钠
0.95345 g,加入到浓硫酸100 mL中,加盖,振摇至十水合四硼酸钠完全溶解,摇匀。咔唑-乙醇溶液(0.125%):精密称取咔唑25 mg,用无水乙醇20 mL溶解,摇匀,于4 ℃冰箱避光保存。
D-葡萄糖醛酸标准曲线的建立:精密称取D-葡萄糖醛酸对照品10 mg,置50 mL量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,制成200 μg/mL的D-葡萄糖醛酸标准储备液。精密量取D-葡萄糖醛酸标准储备液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL,分别置于10 mL具塞试管中,依次分别加入水至1.0 mL,混匀,配成每毫升含20、40、60、80、100 μg的D-葡萄糖醛酸系列溶液,冰浴冷却,边滴加边振摇硼砂–硫酸溶液5.0 mL,混匀,于沸水浴中加热15 min,冰浴冷却,加入咔唑-乙醇溶液0.2 mL,混匀,于沸水浴中加热20 min,冰浴冷却。以空白溶液为参比,于530 nm波长处测定吸收度,以溶液的质量浓度(x,μg/mL)为自变量,吸收度(y,A)为因变量进行线性回归,得线性方程。
双氯芬酸钠标准曲线的建立:精密称取双氯芬酸钠对照品10 mg,置50 mL量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,制成200 μg/mL的双氯芬酸钠标准储备液。精密量取双氯芬酸钠标准储备液0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 mL,置于10 mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,配成每毫升含10、30、50、70、90 μg双氯芬酸钠的系列溶液。以空白溶液为参比,于276 nm波长处测定吸收度,以溶液的浓度(x,μg/mL)为自变量,吸收度(y,A)为因变量进行线性回归,得线性方程。
DF-HA接枝率的计算:精密称取DF-HA 10 mg,加水溶解并稀释至50 mL,摇匀,取上述DF-HA溶液1 mL,余下同D-葡萄糖醛酸标准曲线制备操作,由所测得的吸收度代入标准曲线线性方程中求出DF-HA中D-葡萄糖醛酸的含量,换算得DF-HA中的透明质酸二糖单元的物质的量。取DF-HA溶液,以空白溶液为参比,于276 nm波长处测定吸收度,代入双氯芬酸钠标准曲线线性方程中求出DF-HA中DF的含量,换算得DF-HA中双氯芬酸结构的物质的量。双氯芬酸结构的物质的量与透明质酸二糖单元的物质的量比值即为DF-HA的接枝率。
2.2.3 红外光谱表征
将HA、DF-Na、DF-HA与干燥的KBr按一定比例充分混合研磨,压片后采用Bruker Alpha Ⅱ傅里叶红外光谱仪在400~
4000 cm−1进行检测。2.3 体外释放实验
采用透析法考察DF-HA和DF-Na的体外释放行为,评估DF-HA对DF的缓释效果,释放介质为PBS溶液(pH 7.4)。具体方法如下:将DF-HA、DF-Na、参比制剂分别用3 mL释放介质溶解(DF-Na浓度均为200 μg/mL),置于活化好的透析袋(截留分子量
2000 D)中,使其悬浮在装有30 mL释放介质的离心管中,放入37 ℃的恒温孵育摇床中以100 r/min的速度振荡。在固定的时间点(DF-HA:1,2,3,5,11,21,28和37 d;DF-Na:2,4,6,24和48 h;参比制剂:1,2,3,6,9,14,21和28 d)从释放体系中取出2 mL的释放介质,并添加等温等体积的新鲜介质。取出的样品溶液均通过0.22 μm微孔滤膜过滤后,用高效液相色谱法检测PBS溶液中双氯芬酸的含量。色谱条件如下。色谱柱:Inertsil ODS-SP C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流动相:甲醇-0.1%甲酸水溶液(70∶30);流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:276 nm;进样量:20 μL。
标准曲线的绘制:精密称取双氯芬酸钠10 mg,置于100 mL量瓶中,加PBS溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,精密移取上述溶液25 mL,置于50 mL量瓶中,加PBS溶液稀释至刻度,摇匀,即得50 μg/mL的双氯芬酸钠工作溶液。取一系列体积的双氯芬酸钠工作溶液加PBS溶液配制成质量浓度为0.5、5、10、15、20 μg/mL的系列溶液,进样,记录色谱图。以峰面积(A)为纵坐标,质量浓度(c)为横坐标,进行线性回归,得线性方程。
3. 结 果
3.1 DF-HA的合成
双氯芬酸钠借由间隔基2-氨基乙醇与透明质酸骨架共价键合从而得到双氯芬酸透明质酸钠(DF-HA)接枝共聚物。具体的合成路径是先对2-溴乙基胺的胺基进行Boc保护,然后通过亲核取代在双氯芬酸中引入氨基乙醇结构,再脱Boc保护暴露胺基反应位点,得到2-氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐,以EDC·HCl和NHS为催化剂经过一系列过程与透明质酸结构中的羧基位置形成酰胺结构将双氯芬酸引入到透明质酸结构中,最终得到DF-HA。产物外观为白色粉末,极难溶于水,不溶于乙醇和乙腈等常见有机溶剂,与原研药性质一致。合成路线如图1所示。HA和2-氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐的投料比是影响产物接枝率的重要影响因素,为此,在后续进行DF-HA表征时也考察了HA与2-氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐物质的量比分别为1、2.5和5时产物的接枝率。
3.2 DF-HA的表征
3.2.1 1H NMR图谱解析
HA、2-氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐、DF-HA的1H NMR图谱如图2所示。图2-A为HA的1H NMR图谱,δ4.79为溶剂(D2O)峰,δ4.60,4.50两个双重峰为HA的半缩醛的两个质子峰,δ2.07为HA的甲基质子峰,δ3.94~3.39为HA的剩余质子峰。图2-B为2-氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐的1H NMR图谱,δ7.26为溶剂(CDCl3)峰,δ7.30~6.47为2-氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐中苯环上的7个质子峰,δ4.39,3.94,3.22为3个亚甲基共6个质子峰。图2-C为接枝共聚物DF-HA的1H NMR图谱,对比图谱可以看出,DF-HA中δ7.60~6.57出现了2-氨基乙醇-双氯芬酸中苯环的质子峰,这是双氯芬酸的特征峰,由此推断DF-HA已接枝成功。3种投料比得到的各产物的1H NMR图谱如图3所示。根据δ2.07的积分值(3个质子峰)和δ6.57的积分值(1个质子峰)的比值可以计算出DF-HA的接枝率,HA与2-氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐物质的量比为1、2.5、5的接枝率分别为22.4%、17.4%、8.2%。考虑到产物的溶解性会随着接枝率的增大而减小,且接枝率太低会影响双氯芬酸的释放浓度,最终选用HA与2-氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐物质的量比为2.5的比例作为反应的最优条件。
3.2.2 紫外分光光度法表征结果
通过查阅相关文献,并对HA、DF-Na进行全波长扫描,结果如图4-A、4-B所示,确定DF-Na在276 nm处有较强紫外吸收;而HA在该范围无紫外吸收,仅在近紫外末端有非特征性吸收。DF-HA的全波长扫描结果如图4-C所示,可以看到DF-HA在276 nm处观察到紫外吸收,这是由于DF-HA中引入了双氯芬酸结构产生的,说明DF-HA接枝成功。
D-葡萄糖醛酸的标准曲线回归方程为y =
0.0089 x +0.0118 (R2 =0.9991 ,n = 6),在质量浓度0~98.78 μg/mL范围内呈良好的线性关系;双氯芬酸钠的标准曲线回归方程为y =0.0302 x +0.0181 (R2 =0.9995 ,n = 6),在浓度0~89.55 μg/mL范围内呈良好的线性关系。计算得DF-HA的接枝率为17.2%,与1H NMR表征结果所计算的接枝率17.4%基本相同,并且与原研药通过紫外分光光度法测定得到的接枝率18.0%相比,二者基本一致。3.2.3 FT-IR图谱解析
HA、DF-Na与DF-HA的红外光谱图如图5所示。由图5-A可见,
3410 cm−1为羟基吸收峰,其峰形宽而钝,说明HA分子内羟基通过分子内或分子间氢键缔合;2895 cm−1为C-H伸缩振动吸收峰;1624 ,1409 和615 cm−1为酰胺特征峰;1155 ,1079 ,1040 ,945 cm−1等峰均表明结构中具有C-O-C化学键,为糖的特征吸收峰。由图5-B可见,1573 和1399 cm−1为DF-Na中COO−(C=O)的吸收峰;1502 和1450 cm−1分别为DF-Na分子上N-H的弯曲振动和C-N的伸缩振动吸收峰;1279 和744 cm−1分别为-CN的吸收峰和C-Cl的伸缩振动吸收峰。由图5-C可见,与HA相比,DF-HA的红外光谱图中1509 cm−1为芳香仲胺N-H面内弯曲振动,1453 cm−1为苯环C=C伸缩振动,871和673 cm−1为苯环=CH−H面外弯曲振动,说明DF-HA接枝成功。3.3 体外释放
由1H NMR和紫外分光光度法计算得产物中DF的接枝率为17%,将游离DF-Na、接枝产物DF-HA、参比制剂分别置于透析袋中进行药物体外释放试验,体外药物释放曲线如图6所示,游离DF在4 h内快速释放,随后进入相对稳定的阶段,在6 h后药物释放率达到83.6%,随后释放缓慢,几乎没有变化。而DF-HA在1 d内的释放率为4.8%,在21 d内的释放率为17.7%,药物释放缓慢。在一项研究参比制剂储存条件的试验中,参比制剂在60 ℃,pH 5.1的环境中,21 d内的释放率为16.4%;在40 ℃,pH 5.1的环境中,6个月内的释放率为18.2%[15]。在药物体外释放试验中,参比制剂在1 d内的释放率为4.5%,在21 d内的释放率为21.9%,药物释放同样很缓慢。实验合成的接枝产物DF-HA与参比制剂具有相似的体外释放行为。这是由于在DF-HA接枝共聚物中,DF与间隔基2-氨基乙醇通过酯键连接,间隔基与HA通过酰胺键连接,在释放介质中DF与间隔基之间的酯键部分被水解,DF才缓慢释放出来。以上结果说明,实验合成的DF-HA接枝共聚物可以达到缓释DF的效果,进而提高治疗效果,减少给药频次。
4. 讨 论
骨关节炎是一种慢性病,而现有的药物治疗手段所能达到的持续效果,都需要频繁给药,还可能伴随着不良反应或并发症,这可能导致药物依从性降低。为解决上述问题,研究者进行了多方面的努力。Kang等[16]制备了聚乙二醇化(PEG)/KGN微粒和HA/PEG/KGN水凝胶。体外试验发现,HA/PEG/KGN水凝胶相比于PEG/KGN微粒,显著延长了KGN药物的释放时间。2019年OARSI发布的非手术治疗OA指南推荐KOA患者首选外用NSAIDs治疗,相比于口服NSAIDs,外用NSAIDs的胃肠道不良事件、心血管事件风险显著降低[17−18]。
本研究将HA与DF通过化学反应接枝在一起得到DF-HA接枝共聚物,合成工艺与原研药物相比,中间体的产率大大提高,且缩短了反应时间,终产物的粗品采用透析法除去小分子杂质,较原有工艺产物的纯度有所提高。通过1H NMR、紫外分光光度法和FT-IR确定了目标产物的成功合成,且通过1H NMR和紫外分光光度法确定了DF在HA上的接枝率约为17%。接下来,通过药物体外释放试验研究了DF-HA的释药性能,相较于游离DF,DF-HA能显著实现对DF的缓释效果,且与参比制剂释放行为基本一致,DF可以在患者给药部位长时间发挥抗炎作用和镇痛作用。DF-HA中DF的量也比口服所需的治疗浓度要小得多,全身暴露量少从而可以减少不良反应的发生。这些可以提高患者依从性和治疗效果。除此之外,DF与HA接枝后也改善了DF的疏水性,便于制成注射剂,且高分子量HA本身具有治疗骨关节炎的作用,DF-HA可以结合两者的优点,具有较好的应用价值。
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Figure 1. Analysis of IL-27 expression in the brains of normal and Alzheimer’s disease(AD) patients. In Hippocampus region, control group n=19, AD group n=19. In the entorhinal cortex region, control group n=19, AD group n=15. In the frontal cortex region, control group n=27, AD group n=21. (ns: no significance vs control group)
Figure 2. Effect of IL-27 on activation of microglia in lipopolysaccharide(LPS)-induced mice brain
A: Expression of Iba1 in the brain of normal mice, LPS-induced inflammation mice, and IL-27 treated mice after LPS-induced inflammation was detected by immunohistochemistry (Scale bar=100 μm); B: Quantitative analysis of Iba1+ levels in A ($\bar{x} $ ± s, n=3, ###P < 0.001 vs control group; **P < 0.01 vs LPS group)
Figure 3. Effect of IL-27 on the expression of inflammatory factors in the brain of mice induced by LPS ($\bar{x} $ ± s)
A: mRNA levels of Il1b, Il6 and Tnf were detected by RT-qPCR; B: Levels of IL-1β, IL-6, TNF-α were detected by ELISA; C: Representative images of the levels of IL-1β, TNF-α were detected by Western blot; D-E: Quantitative analysis of protein levels of TNF-α/actin and IL-1β/actin(n=5 in ELISA, the other n=3) ###P < 0.001, ##P < 0.01 vs control group; ***P < 0.001, **P < 0.01 vs LPS group
Figure 4. Effect of IL-27 on mRNA expression of M1/M2 cell markers in LPS-induced microglia ($\bar{x} $ ± s, n=3)
A: mRNA levels of M1-specific makers Il1b, Tnf, Nos2, Nlrp3, Fcgr2b, Cd86 and Fcgr3 were detected by RT-qPCR; B: mRNA levels of M2-specific makers Il10, Chil3 and Arg1 were detected by RT-qPCR ###P < 0.001, ##P < 0.01, #P < 0.05 vs control group; ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05 vs LPS group
Figure 5. Effect of IL-27 on mRNA expression of M1/M2 cell markers in Aβ1-42-induced microglia ($\bar{x} $ ± s, n=3)
A: mRNA levels of M1-specific makers Il1b, Tnf, Nlrp3 and Nos2 were detected by RT-qPCR; B: mRNA levels M2-specific makers of Il10, Chil3 and Arg1 were detected by RT-qPCR ###P < 0.001, ##P < 0.01, #P < 0.05 vs control group; ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05 vs Aβ1-42 group
Figure 6. Effect of IL-27 on activation of NF-κB, p-NF-κB, IκBα, and p-IκBα in microglia induced by Aβ1-42
A: Levels of NF-κB, p-NF-κB, IκBα and p-IκBα were detected by Western blot; B-C: Quantitative analysis of protein levels of p-NF-κB/NF-κB and p-IκBα/ IκBα in A (`x ± s, n=3, ###P < 0.001, ##P < 0.01, #P < 0.05 vs control group; ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05 vs Aβ1-42 group)
Table 1 Primer sequences for RT- PCR
Biological indicator Forward primer (5'→3') Reverse primer (5'→3') Tnf TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG GACGTGGAACTGGCAGAAGAG Il6 TTGGTCCTTAGCCACTCCTT TAGTCCTCCTACCCCAATT Il1b ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT GCAACTGTTCCTGAACTCAACT Nos2 GTGGACGGGTCGATGTCAC GTTCTCAGCCCAACAATACAAA Nlrp3 ACAAGCCTTTGCTCCAGACCCTAT TGCTCTTCACTGCTATCAAGCCCT Fcgr2b GGGAACCAATCTCGTAGTGTCTGT CCAGAAAGGCCAGGATCTAGTG Cd86 GAGCGGGATAGTAACGCTGA GGCTCTCACTGCCTTCACTC Fcgr3 GTCCAGTTTCACCACAGCCTTC GCCAATGGCTACTTCCACCAC Chil3 GGGCATACCTTTATCCTGAG CCACTGAAGTCATCCATGTC Il10 GGTTGCCAAGCCTTATCGGA ACCTGCTCCACTGCCTTGCT Arg1 GTGAAGAACCCACGGTCTGT CTGGTTGTCAGGGGAGTGTT Actb AGCCATGTACCTAGCCATCC TTTGATGTCACGCACGATTT -
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