变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是一种由变应原引起的，由IgE介导的慢性炎症性疾病，主要症状包括鼻塞、流鼻涕、打喷嚏等。AR在一般人群中的全球患病率为3%~19%，并且近年来有上升趋势^[1]，因此迫切需要寻找一种新的治疗AR的可靠方法。

AR的发病机制十分复杂，许多炎症细胞、细胞因子和炎症介质都参与了疾病的发生及发展过程^[2]。变应性疾病的主要发病机制是Th1/Th2细胞失衡^[3]。T-盒细胞转录因子（T-box expressed in T cell，T-bet）是促进Th1细胞分化和功能的关键转录因子，GATA结合蛋白-3（GATA-binding factor 3，GATA-3）是Th2细胞的关键转录因子，GATA-3通过调节多个基因的表达，促进Th2细胞特有的细胞因子产生，如IL-4、IL-5等^[4]。因此，明确药物对AR中T细胞平衡的影响对于研究药物的作用机制十分重要。

AR最常用的治疗药物是抗组胺药及鼻用糖皮质激素，但单独或与其他治疗方法联合使用这些药物时往往伴随许多不良反应^[5]。大麦芽碱是从麦芽中分离出来的一种生物碱^[6]。研究发现，大麦芽碱可以通过抑制SPHK-1/S1PR1/STAT3信号通路发挥对葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）引起的溃疡性结肠炎的抗炎作用^[7]。虽然已经有许多研究证明了大麦芽碱在多种疾病中的有益作用，但其在AR中的作用却鲜有报道。本研究旨在明确大麦芽碱对卵清蛋白（ovalbumin，OVA）诱导大鼠AR的治疗效果及作用机制，为大麦芽碱治疗AR提供理论基础。

1.   材　料

1.1   药品与试剂

大麦芽碱（hordenine，纯度≥95%，上海源叶生物科技有限公司）；卵清蛋白（美国Sigma公司）；HE染色试剂和AB-PAS染色试剂（武汉赛维尔生物科技有限公司）；抗T-bet单克隆抗体（美国Abcam公司）；抗GATA-3抗体、抗PI3K抗体、抗β-Actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IgG（美国Affinity Biosciences公司）；抗Akt（C67E7）单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；抗磷酸化Akt（Ser473）单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；多色预染marker（上海雅酶生物技术有限公司）；氯雷他定糖浆（海南万特制药有限公司）；氢氧化铝凝胶（陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司）；ECL曝光液（北京兰杰柯科技有限公司）；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物有限公司）；脂多糖（LPS，北京索莱宝生物科技有限公司）；大鼠IL-4酶联免疫吸附实验ELISA科研试剂盒、大鼠卵白蛋白特异性IgE（OVA-IgE）ELISA科研试剂盒（江苏酶免实业有限公司）。

1.2   仪　器

水纯化系统（四川沃特尔水处理设备有限公司）；离心机（大龙兴创实验仪器）；电子分析天平（福建华志电子科技有限公司）；电泳、转印系统和化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）；正置荧光显微镜（日本Nikon株式会社）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）。

1.3   动　物

Sprague-Dawley（SD）大鼠，SFP级，6~8周龄，（200 ± 20）g，购自济南朋悦实验动物繁殖有限公司。合格证号：SCKK（鲁）2019-0003。

2.   方　法

2.1   动物实验及分组

本研究动物实验得到济宁医学院动物伦理委员会的批准（伦理号：2021-DW-ZR-019）。首先对大鼠进行1周的适应喂养，将动物置于19~23℃和45%~60%相对湿度下进行12 h/12 h的明暗循环，建立正常的昼夜节律以维持大鼠的正常生理活动，此期间动物可以获得充足的食物和水。随后将40只SD大鼠随机均分为4组：（1）空白对照组（control组）；变应性鼻炎模型组（OVA组）；阳性药组（OVA+氯雷他定组）；给药组（OVA+大麦芽碱组）。

AR大鼠造模过程包括基础致敏阶段和强化致敏阶段。在基础致敏阶段，模型组、阳性药组及大麦芽碱组大鼠给予腹腔注射含Al(OH)₃ 30 mg和OVA 0.3 mg的生理盐水1 mL，而空白组大鼠给予腹腔注射生理盐水1 mL，每2天1次，持续16 d。在强化致敏阶段，空白组大鼠给予生理盐水滴鼻（每鼻孔20 μL），其余3组大鼠给予含OVA 0.8 mg（20 mg/mL）的溶液滴鼻（每鼻孔20 μL），每天1次共15 d。在接下来15 d的给药阶段里，空白组大鼠每2天给予1次生理盐水滴鼻（每鼻孔20 μL），其余3组大鼠每2天给予1次含OVA 0.8 mg（20 mg/mL）的生理盐水滴鼻（每鼻孔20 μL），同时给予大鼠药物灌胃治疗，空白组和模型组大鼠每天1次灌胃生理盐水1 mL，阳性药组大鼠每天1次灌胃氯雷他定1 mL（0.9 mg/kg），给药组大鼠每天1次灌胃大麦芽碱1 mL（50 mg/kg）。最后1日给予大鼠10%水合氯醛麻醉后处死，收集血液，摘取其心、肝、脾、肺、肾，并称重，根据相应大鼠的体重计算脏器系数。分离部分大鼠鼻骨、鼻黏膜和鼻中隔组织制作石蜡组织切片。

2.2   行为学评分

在造模过程中记录大鼠的行为学变化，包括挠鼻、打喷嚏和流涕，并评分。挠鼻次数为0计0分，0~3次计1分，4~6次计2分，大于6次计3分。打喷嚏评分标准和挠鼻相同。无流涕计0分，流涕见于单侧鼻孔计1分，流涕见于双侧鼻孔计2分，流涕超过鼻部计3分。行为学评分总分5分以上表明AR动物模型造模成功。

2.3   病理检测

通过HE染色及AB-PAS染色检测药物对大鼠鼻骨及周围组织病理损伤的缓解程度^[8]，通过ELISA测定大鼠血清中OVA-sIgE和鼻黏膜组织上清液中IL-4的分泌情况^[9]。

2.4   MTT检测药物对细胞增殖的影响

按照文献[10]报道的方法获取大鼠腹腔巨噬细胞。将提取的腹腔巨噬细胞接种于96孔板中，放入恒温培养箱中过夜，第2天使用不同浓度的大麦芽碱（15.625、31.25、62.5、125、250、500 µmol/L）处理24 h。然后每孔加入MTT溶液10 µL，随后每孔加入Formazan溶解液100 µL。使用酶标仪在590 nm波长下读取吸收度，计算细胞活力。细胞活力=（处理样品的吸收度–空白吸收度）/（未处理对照的吸收度–空白吸收度）×100%。

2.5   体外细胞模型构建

将提取的大鼠腹腔巨噬细胞置于6孔培养板中，给予LPS刺激，构建体外细胞模型。实验设为3组：空白组、LPS组和LPS+大麦芽碱组。空白组加入含10%FBS的DMEM培养基2 mL，LPS组每孔加入含LPS（1 μg/mL）溶液的培养基2 mL，LPS+大麦芽碱组每孔加入含LPS（1 μg/mL）和大麦芽碱（82.615 mg/mL）的培养基2 mL，每组设置2个复孔进行后续实验。

2.6   生物信息学分析

使用TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.Php），PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）和Swiss Target Prediction databases（http://www. swisstargetprediction.ch/）获得与大麦芽碱相关靶点，使用GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（http://www.omim.org），获得与AR相关作用靶点。使用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）获得标准化的基因名称。使用Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）筛选出重叠靶点。使用STRING数据库（http://cn.string-db.org），利用重叠靶点构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。使用Cytoscape 3.9.1软件筛选出“药物-疾病”核心靶点。使用AutoDock 4.2.6软件进行分子对接验证大麦芽碱与网络药理学分析筛选出“药物-疾病”部分核心靶点的结合能力。研究方法与以往文献报道一致^[11]。

2.7   免疫组化检测相关蛋白表达

按照文献[12]报道的方法检测药物对鼻骨及周围组织中p-Akt、PI3K、T-bet和GATA-3的表达情况的影响。实验中使用的抗体及浓度分别为：抗p-Akt抗体（l∶200）、抗PI3K抗体（l∶200）、抗T-bet抗体（l∶500）和抗GATA-3抗体（l∶200）。

2.8   Western blot检测相关蛋白表达

按照文献[12]报道的方法检测药物对鼻黏膜组织Akt、p-Akt、PI3K、T-bet和GATA-3蛋白表达量的影响以及药物对LPS刺激下腹腔巨噬细胞中Akt、p-Akt和PI3K蛋白表达量的影响。实验中使用的抗体及浓度分别为：抗Akt抗体（l∶5000）、抗p-Akt抗体（l∶2000）、抗PI3K抗体（l∶2000）、抗T-bet抗体（l∶1000）、抗GATA-3抗体（l∶2000）、抗β-Actin抗体（l∶5000）和HRP标记羊抗兔IgG（l∶10000）。使用Image Pro Plus 6.0软件对图像进行半定量评估^[13]。

2.9   统计学处理

使用SPSS 27和GraphPad Prism软件进行数据分析。所有实验均在相同条件下重复3次，以确保结果的可信度和一致性，实验数据以$ \bar{x}\pm s $表示。对3组及以上数据比较采用One-Way ANOVA分析。以P<0.05认为差异具有统计学意义。

3.   结　果

3.1   大麦芽碱对AR大鼠的行为学表现的影响

记录给予大鼠鼻部OVA刺激后的挠鼻、打喷嚏的次数及流涕情况，并根据鼻炎行为学评分标准计算总行为学评分。如图1-A所示，除空白组外各组大鼠行为学总分均大于5，这表明成功构建了AR动物模型。给予大麦芽碱治疗后，大鼠行为学总分与模型组相比显著降低（P<0.01），说明大麦芽碱改善了AR大鼠的鼻炎相关行为学症状。图1-B和图1-C显示经大麦芽碱治疗后大鼠的挠鼻和打喷嚏次数明显下降。

Figure  1.  Behavioral effects of hordenine on ovalbumin (OVA)-induced allergic rhinitis (AR) rats ($ \bar{x}\pm s $, n=6)

A: Scores of nasal symptoms within 30 min from the nasal stimulation stage to the last intragastric administration; B: Average number of rubbing; C: Average number of sneezing ^* P<0.05, ^** P<0.01 vs control group; ^## P<0.01 vs OVA group

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3.2   大麦芽碱治疗AR的安全性评价

通过计算大鼠重要脏器（心、肝、脾、肺和肾）的脏器系数，肺组织HE染色，提取腹腔巨噬细胞进行MTT实验共同评估大麦芽碱治疗的安全性（结果见图2）。如图2-A所示，模型组大鼠的脾脏脏器系数显著高于对照组（P<0.01），而脾脏脏器系数的增加被大麦芽碱逆转（P<0.01），而其他器官（心、肝、肺和肾）的脏器系数没有差异。肺组织HE结果显示，各组肺泡无扩增或萎缩，肺泡间隔轻度或无扩增（图2-C）。MTT结果显示，大麦芽碱在500 μmol/L时对腹腔巨噬细胞仍没有杀伤作用，证明大麦芽碱具有一定的安全性（图2-B）。

Figure  2.  Safety evaluation of hordenine in the treatment of OVA-induced AR rats ($ \bar{x}\pm s $, n=6)

A: Organ coefficients of important organs (heart, liver, spleen, lungs, and kidneys) in rats; B: Result of MTT assay; C: HE staining of lung tissues ^** P<0.01 vs control group; ^## P<0.01 vs OVA group

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3.3   大麦芽碱对AR导致的鼻黏膜病理损伤的缓解作用

HE染色结果显示，模型组大鼠的鼻黏膜固有层可见炎性细胞浸润及明显的血管充血，而大麦芽碱治疗后明显改善上述症状（图3-A）。AB-PAS染色结果显示，模型组大鼠鼻黏膜杯状细胞形态不规则，杯状细胞分泌的黏液增多，而大麦芽碱治疗后逆转了鼻黏膜杯状细胞形态的变化，并且减少了黏液分泌（图3-B）。随后，在400×显微镜下对大鼠鼻黏膜杯状细胞计数，每个标本随机选取5个高倍视野并计数，使用GraphPad Prism软件进行分析，结果显示模型组大鼠鼻黏膜及邻近组织的杯状细胞数量显著增加（P<0.01），而大麦芽碱治疗后逆转了大鼠鼻黏膜杯状细胞数量的增加（P<0.01）（图3-C）。

Figure  3.  Effects of hordenine on histological alterations in OVA-induced AR rats ($ \bar{x}\pm s $, n=3)

A: HE staining results of the nasal mucosa, the black arrows indicated inflammatory cell infiltration; B: AB-PAS staining of the nasal mucosa; C: Goblet cells count of the nasal mucosa ^** P<0.01 vs control group; ^## P<0.01 vs OVA group

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3.4   大麦芽碱对OVA-sIgE和IL-4分泌的影响

ELISA实验结果显示，模型组大鼠血清中OVA-sIgE的分泌显著高于空白组（P<0.01），大麦芽碱治疗后，OVA-sIgE的分泌显著减少（P<0.01）（图4-A）。模型组大鼠鼻黏膜组织上清液中IL-4的分泌显著高于空白组（P<0.05），经过大麦芽碱治疗后，IL-4的分泌显著减少（P<0.01）（图4-B）。

Figure  4.  Secretion level of OVA-sIgE in rats’ serum (A) and IL-4 in rats’ nasal mucosa tissue supernatant (B) determined by ELISA ($ \bar{x}\pm s $, n=3)

^* P<0.05, ^** P<0.01 vs control group; ^## P<0.01 vs OVA group

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3.5   大麦芽碱对Th1/Th2细胞平衡的影响

免疫组化实验结果显示，模型组大鼠的GATA-3表达增多，T-bet表达减少，而大麦芽碱明显逆转该趋势变化（图5-A）。Western blot实验结果显示，大麦芽碱治疗后，GATA-3的表达量显著降低（P<0.05），T-bet的表达量显著升高（P<0.05）（图5-B）。此外，大麦芽碱组T-bet表达升高（P<0.05），而氯雷他定组没有显著性差异（P > 0.05）。有文献报道，T-bet和GATA-3分别是Th1和Th2细胞的关键转录因子^[14]，因此，认为大麦芽碱可能对T细胞平衡有一定的调控作用。

Figure  5.  Expression of T-bet and GATA-3 in nasal mucosa of AR rats ($ \bar{x} $±s, n=3)

A: IHC results of GATA-3 and T-bet expression in the nasal mucosa tissues, the black arrows point to the positive expression of the target proteins; B: Western blot results of T-bet and GATA-3 expression in the nasal mucosa tissues ^* P<0.05 vs control group; ^# P<0.05 vs OVA group

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3.6   生物信息学分析预测大麦芽碱治疗AR的潜在作用通路

使用TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.Php），PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）和Swiss Target Prediction databases（http://www. swisstargetprediction.ch/）获得与大麦芽碱相关的作用靶点共120个，使用GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（http://www.omim.org）网站，输入关键词“allergic rhinitis”，共获得2383个与AR相关的作用靶点。删除所有重复项，得到120个大麦芽碱相关作用靶点和1264个AR相关靶点（图6）。使用Cytoscape软件，分别构建与大麦芽碱相关靶点相互作用网络以及与AR相关靶点相互作用网络。用Venny 2.1获得28个“大麦芽碱-AR”重叠靶点。STRING数据库创建了一个具有28个节点和68个边的PPI网络。将PPI网络导入Cytoscape软件，获得交叉靶点的拓扑特性，结果中degree为5.230769231，betweenness为34.76923077，closeness为0.01731845。结合拓扑属性表（表1）和网络图（图6），确定了7个核心靶点（AKT1、EGFR、CCL2、PTGS1、SLC6A4，ADRB2和HRH1）。将28个重叠靶点放入Metascape平台（https://metascape.org/gp/index.html），进行京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析和基因本体论（gene ontology，GO）生物功能富集分析，设置筛选标准为P<0.05，结果显示，KEGG分析获得信号通路31条。GO分析获得346项生物功能，包括282项生物过程，29项细胞成分和35项分子功能。

Figure  6.  Network pharmacology analysis results of potential pathways of action of hordenine in the treatment of AR

A: PPI network diagram of AR-related target; B: PPI network diagram of hordenine-related target; C: Venn diagram showing the intersection between hordenine and AR; D: PPI interaction network of hordenine and AR intersection targets; E: KEGG analysis; F: GO analysis

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Table  1.  Topological analysis results of the main target network

Target	Degree	Betweenness	Closeness
AKT1	13	121.85238095	0.02325581
EGFR	12	97.38571428	0.02272727
CCL2	10	39.05714285	0.02083333
PTGS1	8	134.47619047	0.02222222
SLC6A4	7	52.48809523	0.01886792
ADRB2	7	117.69047619	0.02222222
HRH1	7	188.12619047	0.02

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分子对接结果中结合能反映了大麦芽碱与部分核心靶点的结合水平（图7）。一般来说，配体与受体之间的结合能越低，亲和力越高，当结合能小于−29.288 kJ/mol时，表示配体与受体之间有更好的亲和力。分子对接的参考指标为最低结合能，结果表明，大麦芽碱与AKT1的结合能为−29.677112 kJ/mol（表2），说明大麦芽碱与AKT1有很强的亲和力。结合网络药理学分析，初步预测大麦芽碱治疗AR的作用通路可能为PI3K/Akt信号通路，后续通过免疫组化实验以及体内、体外Western blot实验进行验证。

Figure  7.  Diagram of molecular docking of hordenine with the following targets

A: AKT1-hordenine; B: EGFR-hordenine; C: CCL2-hordenine; D: PTGS1-hordenine; E: ADRB2-hordenine; F: HRH1-hordenine

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Table  2.  Binding energy of hordenine for partial core targets

Target	Binding energy/(kJ/mol)
AKT1	−29.677112
EGFR	−30.024384
CCL2	−27.936568
PTGS1	−35.250200
ADRB2	−29.480464
HRH1	−29.672928

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3.7   大麦芽碱对PI3K/Akt信号通路的影响

免疫组化实验结果显示，模型组大鼠的PI3K及p-Akt阳性表达明显增多，而经过大麦芽碱治疗后，逆转了阳性表达的增加。Western blot实验结果显示，模型组大鼠PI3K和p-Akt蛋白表达量显著升高（P<0.01），经过大麦芽碱治疗后，PI3K和p-Akt的蛋白表达量显著降低（图8）。

Figure  8.  Expression of PI3K, p-Akt and Akt in nasal mucosa of OVA-induced AR rats ($ \bar{x}\pm s $, n=3)

A: IHC results of PI3K, p-Akt and Akt expression in nasal mucosa tissues, the black arrows point to the positive expression of the target proteins; B: Western blot of PI3K, p-Akt and Akt in the nasal mucosa tissues ^** P<0.01 vs control group; ^# P<0.05, ^## P<0.01 vs OVA group

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对提取的大鼠腹腔巨噬细胞给予LPS或LPS+大麦芽碱处理后进行Western blot实验，结果显示，LPS组PI3K与p-Akt的表达量显著升高（P<0.05），大麦芽碱治疗后，PI3K与p-Akt的表达量显著降低（图9）。体外细胞实验结果进一步证实大麦芽碱可能是通过调节PI3K/Akt信号通路发挥抗炎作用。

Figure  9.  Effects of hordenine on the expression of PI3K, p-Akt and Akt in peritoneal macrophages ($ \bar{x} \pm s$, n=3)

^* P<0.05 vs control group; ^# P<0.05, ^## P<0.01 vs OVA group

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4.   讨　论

本研究结果显示大麦芽碱可以显著降低AR大鼠的行为学评分。HE及AB-PAS染色结果表明，大麦芽碱可以减轻大鼠鼻黏膜组织固有层的炎症浸润程度，减少鼻黏膜杯状细胞数量（P<0.01）及杯状细胞黏液的分泌，明显缓解AR导致的鼻黏膜病理学损伤。ELISA实验结果显示，大麦芽碱治疗减少了OVA-sIgE以及IL-4的分泌。总的来说，大麦芽碱对AR有明显的缓解作用。虽然大麦芽碱与氯雷他定在动物实验中疗效相当，但是氯雷他定作为一种抗组胺药物，长期使用会带来嗜睡等不良反应，而大麦芽碱作为一种药食同源的中药大麦芽中提取的一种生物碱，安全性较好，大麦芽碱AR的治疗过程中可能会展现出相对较小的不良反应，后续实验将进一步验证。

AR的发生和发展受多种因素的影响，Th1/Th2细胞的失衡在AR发展中发挥重要作用。对大鼠鼻黏膜组织进行Western blot实验和大鼠鼻骨及周围组织的免疫组化的实验结果表明大麦芽碱减少了GATA-3的表达，增加了T-bet的表达。因此，大麦芽碱抗炎作用可能与调节Th1/Th2平衡有关。

PI3K/Akt信号通路具有广泛的功能。以往研究表明，黄连碱可以通过该信号通路抑制肥大细胞脱颗粒来改善OVA诱导的AR症状^[15]。生物信息学预测大麦芽碱可能是通过PI3K/Akt信号通路在AR中发挥抗炎作用。随后对大鼠鼻黏膜组织以及腹腔巨噬细胞中该信号通路进行研究，结果表明，在体内组织和细胞模型中，大麦芽碱均能显著降低PI3K及p-Akt蛋白表达水平。综上所述，大麦芽碱可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路在AR中发挥抗炎作用。

PI3K/Akt通路在调节T细胞发育、功能和稳定性中发挥重要作用^[16]。已经有研究证实白僵菌可以通过该信号通路改变T细胞平衡，治疗DSS诱导的溃疡性结肠炎^[17]。然而，在AR中PI3K/Akt信号通路与Th1/Th2细胞平衡之间的关系尚未得到明确报道。在后续实验中将利用siRNA/质粒转染或加入相关抑制剂和激活剂，明确PI3K/Akt信号通路在药物调控Th1/Th2细胞平衡中的影响。