聚合物微粒和纳米粒用于疫苗的粘膜给药
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摘要: 微球和纳米粒口服后可完整穿越胃肠道而被吸收,因此可作为不稳定或大分子药物的口服载体,此外,微球也已用于疫苗的口服输送,诱导产生有效的免疫应答和防御性免疫。然而,微球穿越肠道的吸收程度将限制其作为口服给药载体的可行性。鼻内免疫也将是诱导粘膜免疫相当有吸引力的途径。微球也可将疫苗输送至呼吸道。目前大量研究表明,许多聚合物给药系统在疫苗粘膜给药方面具备很大的潜力。但是,许多领域的工作尚需进一步展开,包括
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传统流行病学调查方法主要基于问卷调查、全国人口普查、既往文献、临床病例报告、临床用药量统计和市场调查,调查成本较高,且数据相对不实时,部分基于问卷调查的数据,可能存在一定的主观性[1]。为了获得更可靠的结果,考虑并应用了基于污水的流行病学(waste water-based epidemiology,WBE)。WBE由Daughton等[2]于2001 年首次提出,阐述了利用药物在人体内代谢的比例等数据以及结合污水中浓度、污水处理厂服务人口数量等数据反推某地区药物消耗量的方法。将药物作为污水中的标志物进行监测用于评估疾病患病率已被认为是一种主要的 WBE 研究方向[3−8],例如分别以拉米夫定[1]、别嘌呤醇[3]、二甲双胍[5]作为生物标志物评估乙肝、痛风和糖尿病的患病率。
我国目前上市的抗流感病毒药物有神经氨酸酶抑制剂、血凝素抑制剂和M2离子通道阻滞剂3种,其中神经氨酸酶抑制剂是目前流感治疗指南推荐的首选药物[9]。奥司他韦是首个口服有效的特异性流感病毒神经氨酸酶抑制剂[10],可供成人与儿童使用。数据统计表明[11],2019年奥司他韦用药频度(DDDs)值居于南京地区使用的各种抗流感病毒药物首位,为防治流感病毒的一线用药,占据临床与市场的主导地位。根据文献研究[12−13],奥司他韦在给药后大约60%的剂量以奥司他韦酸的形式通过尿液排出,且奥司他韦酸在生活污水及其处理中较为稳定。因此,选择奥司他韦酸作为评估流感流行情况的生物标志物。
本研究建立了测定污水样本中奥司他韦酸的方法,以江苏省和安徽省两省内5座城市为研究对象,选择的46个污水处理厂进行季度采样,应用污水流行病学的方法测定污水中奥司他韦酸的浓度、反推计算奥司他韦千人均消费量和使用率、分析变化趋势,为流感的流行提供近实时的数据支持。
1. 材 料
1.1 药品与试剂
奥司他韦酸、奥司他韦酸-D3(甄准生物科技有限公司);甲醇、乙腈(色谱纯,美国Tedia公司);甲酸、盐酸、氨水(分析纯,南京化学试剂股份有限公司);GF/CTM无黏合剂玻璃纤维滤纸(英国Whatman公司);去离子水(市售娃哈哈纯净水)。
1.2 仪 器
LCMS-
8060 三重四极杆液相色谱质谱联用仪(日本Shimadzu公司);Visiprep 24TM DL固相萃取装置(美国Supelco公司);SPE 柱60 mL及Agela 小柱连接配适器(美国Agela公司);Oasis Prime MCX固相萃取柱(美国Waters公司);D3415R低温冷冻离心机(瑞士BioTool公司)。2. 方 法
2.1 检测条件
2.1.1 色谱条件
Shimpack GIST C18-AQ 色谱柱(2.1 mm×100 mm, 3.0 µm),柱温40 ℃,0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)流动相,流速0. 30 mL/min,线性梯度洗脱程序为(A∶B):0 min(95∶5)→3.0 min(75∶25)→6.0 min(0∶100)→8.0 min(0∶100)→8.1 min(95∶5)→10.1 min(95∶5)。
2.1.2 质谱条件
电喷雾正离子化;喷雾电压:3.5 kV;雾化器气体(N2)流速3 L/min;加热气体(N2)流速10 L/min;DL温度250 ℃;加热块温度400 ℃;干燥气体(N2)流速10 L/min;多反应监测模式(MRM)检测。奥司他韦酸母离子为285.1,定量子离子为180.0,定性子离子为138.0,碰撞电压分别为−10 eV和−14 eV;奥司他韦酸-D3母离子为285.1,定量子离子为183.0,定性子离子为139.0,碰撞电压分别为−19 eV和−30 eV。
2.2 样品前处理
2.2.1 过滤
所取污水样品于−20 ℃条件下冷冻保存,待分析时先融化,然后进行分析。分析前取样品,经GF/CTM无黏合剂玻璃纤维滤纸过滤去除固体颗粒物。
2.2.2 固相萃取
取过滤后水样50 mL,加入工作内标溶液(含奥司他韦酸-D3 25 ng/mL)100 μL,用盐酸调至pH 2,充分振摇混合均匀。选用Oasis Prime MCX固相萃取柱对样品中目标物进行富集。样品以4 mL/min速度过柱上样,上样完成后先用甲醇4 mL淋洗,最后用5% 氨水-乙腈溶液4 mL洗脱(流速1 mL/min)。收集的洗脱液于50 ℃氮气吹干,加入5% 乙腈-水溶液120 μL复溶,涡旋5 min;4 ℃,
13000 r/min 条件下离心取上清液100 μL进UPLC-MS/MS分析。2.3 方法与验证
2.3.1 标准曲线和范围
取奥司他韦酸对照品溶液适量,用甲醇逐级稀释,分别配制成含奥司他韦酸质量浓度分别为0.75,1.5,3.75,7.5,15,37.5,75,150,375,750 ng/mL的系列标准溶液。取各标准溶液 100 μL,内标溶液 100 μL,分别用纯水 50 mL 配制成模拟样品。按“2. 2. 2”项进行试验,记录色谱图,以目标物峰面积与内标峰面积之比 Y对目标物浓度与内标浓度之比X进行权重(1/X 2)回归分析。结果表明,奥司他韦酸在1.5~
1500 ng/L范围内,r均大于0. 99,质谱响应呈良好线性关系。2.3.2 准确度与精密度
取奥司他韦酸对照品溶液适量,用甲醇逐级稀释,配制成质量浓度分别为2.5,250,500 ng/mL的质量控制溶液。取上述不同浓度的质量控制溶液、内标溶液各 100 μL,分别用纯水50 mL配制成含奥司他韦酸5 ng/L、500 ng/L、
1000 ng/L的低、中、高浓度质控样品,按“2. 2. 2”项下操作,每一浓度进行 6 样本分析,连续测定 3 d。结果表明,准确度均值在质控样品标示值的 96.5%~112.5%范围内,批内和批间精密度的 RSD 在 0.69% ~7.83%范围内,均可达到实验要求。2.3.3 回收率和基质效应
取污水基质 50 mL,按“2. 3. 2”项下,配制成低、中、高3 个浓度的质控样品各6份,按“2. 2. 2”项下方法平行操作,作为回收率样品组。另取污水基质 50 mL,加入甲醇 100 μL,进行固相萃取操作,向洗脱液中加入低、中、高3个浓度的工作溶液100 μL 和内标溶液 100 μL,每一浓度各6份,按“2. 2. 2”项下方法操作,作为回收率对照组(基质效应样品组)。取5% 氨水-乙腈溶液4 mL,加入低、中、高 3 个质量浓度的工作溶液100 μL 和内标溶液 100 μL,每个浓度平行3份,按“2. 2. 2”项下方法操作,作为基质效应对照组。记录目标物及其对应内标峰面积,扣除污水基质中目标物峰面积后,计算目标物的回收率和基质效应。结果表明,回收率在95.81%~100.54%范围内,基质效应在94.53%~102.13%范围内,二者的RSD在0.69%~2.06%范围内,符合方法学要求。
2.3.4 奥司他韦千人均消耗量及使用率计算
污水处理厂所在服务区的奥司他韦千人均消耗量Q可通过公式(1)计算:
$$ Q=\frac{C\times {V}_{{\mathrm{in}}}\times 1\;000}{\mathrm{P}\mathrm{O}\mathrm{P}}\times F\times 10 $$ (1) 式中,Q 为千人均消费量,单位为 mg/
1000 inh/d(inh为inhabitant缩写,1000 inh代表1000 人);POP 为污水处理厂覆盖人口总数;c为污水中检出该药物代谢物质量浓度(ng/L);Vin表示污水处理厂进水流量(104 t/d);F代表折算校准系数,计算公式见公式(2)。其中,折算系数的计算公式为:
$$ F=\frac{{\text{MW}}_{{\mathrm{OS}}}}{{\text{MW}}_{{\mathrm{OC}}}}\times \frac{1}{{\text{Excretion}}_{{\text{OC-OS}}}} $$ (2) 式中,ExcretionOC-OS表示奥司他韦酸的人体排泄率60%[12];MWOS和 MWOC分别表示奥司他韦和奥司他韦酸的相对分子质量。
奥司他韦的使用率PRoseltamivir(‰)可通过公式(3)计算:
$$ {PR}_{{\text{oseltamivir}}}=\frac{Q}{D\times n\times 1\;000} \times1\;000{\text{‰}} $$ (3) 式中,n为奥司他韦每日的使用频率,一日两次;D(mg)是奥司他韦单剂量需求量,75 mg。
3. 结果与讨论
3.1 污水样本的采集
选取了江苏省的无锡市和常州市以及安徽省的蚌埠、铜陵和宿州市共5座城市,在2022年11月至2023年12月间进行了连续4个或5个季度的采样。采样点包括46个城市污水处理厂。采样月份和对应的季度信息如表1所示。每个污水处理厂的采样时间为2 d(一般包括1个工作日和 1个休息日)。
Table 1. Sampling time and corresponding quarters of wastewater samples in five citiesCity 2022 Q4 2023 Q1 2023 Q2 2023 Q3 2023 Q4 Suzhou Nov.11th,12th Feb.26th,27th May.19th,20th Sept.5th,10th Tongling Nov.5th,7th Feb.15th,18th May.11th,14th Aug.19th,21st Bengbu Feb.5th,6th May.14th,15th Aug.9th,13th Dec.16th,20th Wuxi Mar.18th,20th Jun.15th,18th Sept.14th,17th Dec.14th,17th Changzhou Nov.16th,19th Feb.15th,18th May.17th,20th Aug.16th,19th Nov.16th,18th Note: Q in the title line is the abbreviation of the quarter 3.2 浓度分布与统计比较
测样结果表明,无锡、蚌埠、铜陵和宿州4座城市各季度污水样本中奥司他韦酸检出率为100%。常州市2023年Q2的污水样本中,奥司他韦酸检出率较低,为72%,其余季度检出率为98%~100%。Shao等[7]对大连市2022年4月至2023年3月内22个污水处理厂采集的样本中奥司他韦原型进行了检测,检出率仅为35.2%,其原因主要是奥司他韦仅4%的比例以原型通过尿液排出[12],且其采样时间主要为新冠感染控制期间,流感患病率较低,奥司他韦使用率较低。
奥司他韦酸在4个季度中检出的质量浓度范围为1.270~
1279 ng/L,5座城市各季度检出的奥司他韦酸浓度均值如表2所示,2023年Q1的无锡、Q2的铜陵以及Q4的无锡、常州和蚌埠的污水样本中均检出了较高浓度的奥司他韦酸。无锡市2023年Q4的污水样本中奥司他韦酸(140.7~1279 ng/L)与2009 年挪威流感大流行期间的观察值 (28~1213 ng/L)[13]接近,高于日本 2008−2009 年和 2009−2010 年流感季节期间污水处理厂进水样中观察值(140~460 ng/L)[14],平均浓度(708.2 ng/L)高于2009年英国秋季流感高峰期间污水处理厂进水平均浓度(350 ng/L,443 ng/L)[15]。Table 2. Mean concentration of oseltamivir carboxylate in 5 cities in each quarterCity 2022 Q4 2023 Q1 2023 Q2 2023 Q3 2023 Q4 Suzhou 19.32 ± 15.25 32.49 ± 18.43 110.7 ± 75.51 24.81 ± 24.96 Tongling 55.08 ± 49.27 32.12 ± 15.91 255.8 ± 85.68 45.15 ± 16.70 Bengbu 8.02 ± 4.31 168.5 ± 56.40 47.56 ± 22.12 265.5 ± 96.60 Wuxi 304.0 ± 143.4 26.21 ± 12.43 19.75 ± 11.11 708.2 ± 262.0 Changzhou 24.85 ± 23.35 11.94 ± 20.72 100.8 ± 85.83 18.13 ± 13.65 130.1 ± 152.6 3.3 奥司他韦的千人均消耗量、使用率与流感流行情况
如图1和图2所示,蚌埠、铜陵、宿州和常州4座城市在2022 Q4−2023 Q4期间奥司他韦千人均消耗量和使用率呈现相似的变化趋势,在2022 Q4 和2023 Q1稳定在较低水平,在2023年Q2和Q4增加,而无锡市奥司他韦千人均消耗量和使用率在2023 Q1和Q4大幅增加,Q2和Q3稳定在较低水平。
比较5座城市的采样时间可知,无锡市2023 Q1和Q2的污水样本采集时间分别为3月下旬和6月中旬,而其余4座城市的污水样本采集时间为2月和5月中旬。结合中国疾病预防控制中心统计数据[16]和中国疾控中心病毒病所国家流感中心专家分析[17]可以对2022年Q4−2023年Q1的结果进行解释,既往我国秋冬季流感流行季一般从11月底左右开始,次年1月达到高峰,持续到3月左右,而2022年12月至2023年1月,恰逢新型冠状病毒流行,防控新型冠状病毒感染的措施同时对季节性流感防控也非常有效,使得流感流行减少。2023年初对新型冠状病毒感染实行“乙类乙管”后,人员流动和社会活动常态化,以甲型H1N1亚型为主的流感活动造成了春季流感高峰,在2023年2月底流感活动快速上升,故在2023年3月的无锡市污水样本中检出高浓度的奥司他韦酸,奥司他韦使用量大幅增加。结合国家流感中心监测周报对2023年Q2的结果进行分析,宿州、铜陵、蚌埠和常州市出现的奥司他韦消耗量增加对应第19周(5月8日−5月14日)周报中的A(H1N1)pdm09(季节性甲型 H1N1 亚型流感病毒)和 A(H3N2)(季节性甲型 H3N2 亚型流感病毒)流感病毒共同流行[18],而无锡市奥司他韦的低使用率与第24周(6月12日–6月18日)周报中南方省份低水平的流感活动相对应[19]。
2023年Q4的无锡、常州和蚌埠市,奥司他韦千人均消耗量范围为267.4~544.7 mg/d,使用率范围为1.78‰~3.63‰,反映出2023年冬季流感的大流行。结合国家流感中心监测周报来看,3座城市污水样本的采集时间对应的为第 46 周(11月13日−11月19日)和第50周(12月11日−12月17日),南方省份流感病毒检测阳性率均呈上升趋势,全国报告流感样病例暴发疫情数均达200起以上[20−21]。
4. 结 论
本研究建立了污水样本中抗流感病毒药物奥司他韦主要代谢产物奥司他韦酸的固相萃取- UPLC - MS/MS分析测定方法。以5座城市为调查对象,基于污水流行病学方法,以污水样本中奥司他韦酸的浓度,反推计算奥司他韦千人均消耗量和使用率。结果表明,在2023年3月无锡市出现春季流感高峰;2023年5月蚌埠、铜陵、宿州和常州市出现小的夏季流感高峰;2023年11月和12月无锡、常州和蚌埠市出现冬季流感高峰。研究结果与国家疾控中心和国家流感中心官方统计数据反映的南方城市流感流行情况基本一致。本研究提供了一种评估流感流行情况的方法,将这种方法与临床诊断率相结合可以为未来的流感防控工作提供近实时的数据支持。
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