超氧阴离子（O₂⁻）是活性氧簇（ROS）的一种，在细胞呼吸和免疫系统中发挥重要作用，积累的O₂⁻可以损伤细胞内的线粒体和DNA，诱导细胞凋亡^[1]。所以，选择性提高肿瘤细胞内的O₂⁻含量可以抑制肿瘤细胞的生长和转移，是一种潜在的抗肿瘤策略。代表性的能生成O₂⁻的结构有对苯二醌和邻苯二醌等^[2]。Chakrapani课题组报道了5-羟基-1,2,3,4,4a,9a-六氢-1,4-亚乙基-9,10-蒽醌（HAQ-OH），其5位酚羟基可与10位羰基形成分子内氢键，促进HAQ-OH互变为烯醇式，并进一步在氧化为5-羟基-1,2,3,4-四氢-1,4-亚乙基-9,10-蒽醌（AQ-OH）的同时将O₂还原为O₂^−[3]。

β-半乳糖苷酶的活性在卵巢癌等肿瘤细胞中显著升高^[4]。因此，β-半乳糖苷前药可选择性地在肿瘤细胞内释放毒性药物。此外，肿瘤细胞由于Warburg效应过表达糖转运蛋白，进一步提高了β-半乳糖苷前药的肿瘤细胞靶向性。本课题选择HAQ-OH和AQ-OH为母药，设计并合成了新型β-半乳糖苷前药Gal-HAQ和Gal-AQ（图1）。前药半乳糖上的乙酰基经酯酶水解后响应β-半乳糖苷酶释放酚中间体，经1,6-消除释放原药HAQ-OH和AQ-OH，两者经氧化还原循环生成O₂⁻。鉴于1,6-消除连接臂苯环上的取代基对前药的稳定性和原药释放效率有显著影响^[5]，还合成了两个连接臂苯环上带有硝基的前药Gal-HAQ-NO₂和Gal-AQ-NO₂，以进一步研究其构效关系。

Figure  1.  Design of O₂⁻-releasing β-galactoside prodrugs of 5-hydroxy-1,2,3,4,4a,9a-hexahydro-1,4-acetyl-9,10-anthraquinone (HAQ-OH) and 5-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-ethylidene-9,10-anthraquinone (AQ-OH)

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1.   材　料

1.1   试　剂

本研究所用化学品及试剂均为市售分析纯。

1.2   仪　器

Avance Ⅲ 400 MHz核磁共振仪、Avance Ⅲ 600 MHz核磁共振仪（德国布鲁克公司）；TSQ Quantum Ultra EMR质谱仪、BioTek Epoch2酶标仪（美国赛默飞世尔公司）；1260 Infinity高效液相色谱（美国安捷伦科技公司）；BD Accuri C6 Plus流式细胞仪（美国BD公司）；Axio Imager Z2荧光显微镜（德国卡尔蔡司公司）。

1.3   细　胞

人卵巢癌细胞OVCAR-3、人肺癌细胞A-549、人胚胎肾细胞HEK-293、人肝正常细胞L-02均由江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室提供。

2.   合成部分

如路线1所示，以1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-β-D-半乳糖为原料，其端基位乙酰基在氢溴酸和乙酸条件下溴代得到溴糖1。溴糖1在氢氧化钠条件下与4-羟基苯甲醛或3-硝基-4-羟基苯甲醛发生糖基化反应分别得到糖苷2a和2b。用硼氢化钠还原化合物2a和2b的醛基得到苄醇3a和3b^[6]，并进一步用三溴化磷溴代其苄位羟基得到化合物4a和4b。最后，化合物4a和4b在氧化银催化下分别与HAQ-OH和AQ-OH发生取代反应得到前药Gal-HAQ、Gal-AQ、Gal-HAQ-NO₂和Gal-AQ-NO₂。HAQ-OH和AQ-OH按文献报道的方法合成^[3]。中间体1、2a ~ 2b、3a ~ 3b和4a ~ 4b的表征数据见补充材料。

  1.  Synthetic route of target prodrugs Gal-HAQ, Gal-AQ, Gal-HAQ-NO₂, and Gal-AQ-NO₂

Reagents and conditions: (a) CH₂Cl₂, HBr, CH₃COOH, r.t.; (b) CH₂Cl₂, H₂O, NaOH, 4-hydroxybenzaldehyde or 3-nitro-4-hydroxybenzaldehyde, r.t.; (c) THF, NaBH₄, r.t.; (d) CH₂Cl₂, PBr₃, r.t.; (e) CH₂Cl₂, Ag₂O, HAQ-OH or AQ-OH, r.t..

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2.1   中间体4a ~ 4b的合成

将中间体3（2 mmol, 1 eq.）溶于干燥二氯甲烷（8 mL）中，在0 ℃下逐滴加入三溴化磷（95.4 μL, 1 mmol），搅拌30 min后恢复至室温后继续反应2 h。用饱和碳酸氢钠溶液猝灭反应，后用二氯甲烷稀释。分离有机相用饱和氯化钠洗涤。收集有机相经无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗品。不经纯化直接用于下一步。

2.2   β-半乳糖苷前药的合成

在氩气保护下，将中间体4（0.2 mmol, 1 eq.）和化合物AQ-OH或HAQ-OH（0.3 mmol, 1.5 eq.）溶于无水二氯甲烷（5 mL），加入氧化银（139.0 mg, 0.6 mmol），于室温下反应12~24 h。反应液经硅藻土过滤，减压浓缩后得到粗品。粗品经硅胶柱初纯化（乙酸乙酯-石油醚，1∶2），后经制备液相纯化得到目标前药。

前药Gal-HAQ-NO₂　　淡黄色固体（61.8 mg，12.1%）：mp 220.8 ~ 221.8 ℃。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ: 7.95 ~ 7.97 (1H, t, J = 1.9 Hz, Ar-H), 7.83 ~ 7.88 (1H, dt, J = 8.8, 2.7 Hz, Ar-H), 7.61 (1H, d, J = 2.3 Hz, Ar-H), 7.60 (1H, s, Ar-H), 7.46 (1H, d, J = 8.6 Hz, Ar-H), 7.20 ~ 7.24 (1H, dd, J = 5.8, 3.6 Hz, Ar-H), 6.13 ~ 6.24 (2H, m, AQ-2和AQ-3), 5.55 ~ 5.61 (1H, dd, J = 10.5, 7.9 Hz, Gal-2), 5.48 ~ 5.52 (1H, dd, J = 3.4, 1.2 Hz, Gal-4), 5.19 (2H, d, J = 2.5 Hz, CH₂), 5.11 ~ 5.16 (1H, dd, J = 10.5, 3.4 Hz, Gal-3), 5.11 (1H, d, J = 8.1 Hz, Gal-1), 4.26 ~ 4.32 (1H, dd, J = 11.3, 6.9 Hz, Gal-6), 4.17 ~ 4.23 (1H, dd, J = 11.3, 6.2 Hz, Gal-6), 4.07 ~ 4.13 (1H, t, J = 6.5 Hz, Gal-5), 3.35 (2H, d, J = 6.0 Hz, AQ-1和AQ-4), 3.25 (2H, d, J = 1.5 Hz, AQ-4a和AQ-9a), 2.22, 2.16, 2.12, 2.04 (12H, 4s, OCOCH₃), 1.71 ~ 1.78 (2H, m, AQ-CH₂), 1.39 ~ 1.45 (2H, m, AQ-CH₂)。¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 197.93, 196.16, 170.49, 170.33, 170.28, 169.55, 156.80, 149.08, 138.87, 134.47, 134.24, 133.73, 132.61, 132.48, 126.46, 123.67, 123.65, 120.28, 119.84, 118.75, 100.97, 71.60, 70.71, 69.55, 67.98, 66.85, 61.45, 34.45, 34.39, 33.80, 33.74, 29.85, 24.78, 24.74, 20.83, 20.81, 20.72。MS m/z Calcd. for C₃₇H₃₇NO₁₅ (M+Na)⁺ 758.6, Found 758.3。

前药Gal-AQ-NO₂　　黄色固体（69.9 mg，17.7%）：mp 232.0 ~ 232.6 ℃。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ: 8.05 (1H, d, J = 2.3 Hz, Ar-H), 7.92 ~ 7.97 (1H, dt, J = 8.8, 2.8 Hz, Ar-H), 7.81 (1H, d, J = 7.6 Hz, Ar-H), 7.60 ~ 7.66 (1H, t, J = 8.0 Hz, Ar-H), 7.47 (1H, d, J = 8.6 Hz, Ar-H), 7.27 (1H, d, J = 8.6 Hz, Ar-H), 6.38 ~ 6.46 (2H, dt, AQ-2和AQ-3), 5.53 ~ 5.60 (1H, dd, J = 10.5, 7.9 Hz, Gal-2), 5.48 (1H, d, J = 3.4 Hz, Gal-4), 5.17 ~ 5.26 (2H, t, J = 2.4 Hz, CH₂), 5.09 ~ 5.14 (1H, dd, J = 10.6, 3.3 Hz, Gal-3), 5.09 (1H, d, J = 8.1 Hz, Gal-1), 4.52 ~ 4.57 (1H, m, AQ-1), 4.46 ~ 4.51 (1H, m, AQ-4), 4.24 ~ 4.31 (1H, dd, J = 11.3, 6.9 Hz, Gal-6), 4.15 ~ 4.21 (1H, dd, J = 11.4, 6.2 Hz, Gal-6), 4.05 ~ 4.11 (1H, t, J = 6.6 Hz, Gal-5), 2.20, 2.15, 2.11, 2.02 (12H, 4s, OCOCH₃), 1.49 ~ 1.55 (2H, m, AQ-CH₂), 1.36 ~ 1.43 (2H, m, AQ-CH₂)。¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 181.23, 181.00, 170.49, 170.33, 170.27, 169.56, 158.03, 152.40, 149.05, 148.47, 141.44, 135.11, 134.62, 134.09, 134.00, 132.69, 132.35, 123.62, 120.84, 120.38, 120.34, 119.45, 101.02, 71.60, 70.73, 69.50, 68.00, 66.86, 61.46, 34.44, 34.04, 24.86, 24.84, 20.84, 20.81, 20.80, 20.72。MS m/z Calcd. for C₃₇H₃₅NO₁₅ (M+Na)⁺ 756.6, Found 756.3。

前药Gal-HAQ　　黄色固体（70.9 mg，21.4%）：mp 198.2 ~ 198.9 ℃。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ: 7.51 ~ 7.58 (2H, m, 2Ar-H), 7.49 (2H, d, J = 8.6 Hz, 2Ar-H), 7.20 ~ 7.24 (1H, dd, J = 7.1, 2.3 Hz, Ar-H), 7.06 (2H, d, J = 8.7 Hz, 2Ar-H), 6.12 ~ 6.23 (2H, m, AQ-2和AQ-3), 5.46 ~ 5.54 (2H, dd, m, Gal-2和Gal-4), 5.17 (2H, d, J = 3.5 Hz, CH₂), 5.10 ~ 5.15 (1H, dd, J = 10.5, 3.4 Hz, Gal-3), 5.07 (1H, d, J = 7.9 Hz, Gal-1), 4.22 ~ 4.28 (1H, dd, J = 11.3, 6.9 Hz, Gal-6), 4.15 ~ 4.21 (1H, dd, J = 11.3, 6.4 Hz, Gal-6), 4.05 ~ 4.10 (1H, td, J = 6.6, 1.2 Hz, Gal-5), 3.34 (2H, d, J = 3.3 Hz, AQ-1和AQ-4), 3.24 (2H, t, J = 1.2 Hz, AQ-1a和AQ-4a), 2.21, 2.09, 2.09, 2.04 (12H, 4s, OCOCH₃), 1.69 ~ 1.76 (2H, m, AQ-CH₂), 1.38 ~ 1.44 (2H, m, AQ-CH₂)。¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 198.11, 196.14, 170.52, 170.39, 170.28, 169.54, 157.32, 156.81, 138.74, 134.28(2C), 133.61, 131.28, 128.60, 126.40, 119.13, 118.82, 117.27, 99.84, 71.16, 70.96, 70.68, 68.74, 66.97, 61.44, 52.20, 51.10, 34.33, 34.30, 33.62, 33.60, 24.77, 24.71, 20.89, 20.82(2C), 20.74。MS m/z Calcd. for C₃₇H₃₈O₁₃ (M+Na)⁺ 713.6, Found 713.3。

前药Gal-AQ　　黄色固体（67.8 mg，14.3%）：mp 207.4 ~ 208.0 ℃。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ: 7.74 ~ 7.77 (1H, dd, Ar-H), 7.58 (1H, t, J = 8.0 Hz, Ar-H), 7.54 (2H, d, J = 8.6 Hz, 2Ar-H), 7.26 ~ 7.29 (1H, dd, J = 9.1, 1.5 Hz, Ar-H), 7.06 (2H, d, J = 8.6 Hz, 2Ar-H), 6.38 ~ 6.45 (2H, m, AQ-2和AQ-3), 5.47 ~ 5.52 (1H, dd, J = 10.5, 8.0 Hz, Gal-2), 5.45 ~ 5.47 (1H, dd, J = 3.9, 1.1 Hz, Gal-4), 5.20 (2H, d, J = 3.1 Hz, CH₂), 5.09 ~ 5.13 (1H, dd, J = 10.4, 3.4 Hz, Gal-3), 5.05 (1H, d, J = 8.0 Hz, Gal-1), 4.52 ~ 4.56 (1H, dt, J = 5.5, 2.1 Hz, AQ-1), 4.45 ~ 4.50 (1H, dt, J = 4.2, 2.1 Hz, AQ-4), 4.20 ~ 4.26 (1H, dd, J = 11.3, 6.9 Hz, Gal-6), 4.14 ~ 4.19 (1H, dd, J = 11.3, 6.4 Hz, Gal-6), 4.04 ~ 4.09 (1H, td, J = 6.6, 1.2 Hz, Gal-5), 2.19, 2.08, 2.07, 2.02 (12H, 4s, OCOCH₃), 1.47 ~ 1.54 (2H, m, AQ-CH₂), 1.36 ~ 1.42 (2H, m, AQ-CH₂)。¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 181.31, 181.01, 170.41, 170.28, 170.17, 169.44, 158.53, 156.72, 152.30, 148.13, 134.88, 134.32, 133.97, 133.88, 131.19, 128.45(2C), 120.49, 119.63, 119.38, 117.21(2C), 99.77, 71.05, 70.86, 70.52, 68.63, 66.87, 61.34, 34.31, 33.86, 29.71, 24.74, 20.78, 20.71(2C), 20.63。MS m/z Calcd. for C₃₇H₃₆O₁₃ (M+Na)⁺ 711.6, Found 711.3。

2.3   制备液相条件

Eclipse XDB-C₁₈高效液相色谱柱（9.4 mm × 250 mm，5 μm）。流动相：水-乙腈，流速0.5 mL/min。流动相洗脱梯度：0~5 min，10%→70%乙腈；5~15 min，70%→90%乙腈；15~20 min，90%→10%乙腈。前药Gal-AQ-NO₂和Gal-AQ通过上述制备液相条件得到，且纯度均大于99%。

3.   药理活性

3.1   前药的细胞毒性测试

以原药HAQ-OH和AQ-OH为阳性对照，采用MTT比色法^[7]测试前药对OVCAR-3、HEK-293和L-02细胞的增殖抑制活性。OVCAR-3为过表达β-半乳糖苷酶的卵巢癌细胞，HEK-293和L-02细胞均为β-半乳糖苷酶含量较低的非肿瘤细胞^[8]。如表1所示，与细胞孵育48 h后，前药Gal-HAQ和Gal-AQ则选择性地抑制了OVCAR-3细胞的增殖，两者对OVCAR-3细胞的IC₅₀分别为23.8 和105.6 μmol/L与原药HAQ-OH和AQ-OH接近（22.0, 37.7 μmol/L）。然而，Gal-HAQ和Gal-AQ对非肿瘤细胞HEK-293和L-02的毒性明显下降，其IC₅₀均大于800 μmol/L，而两个原药对这两种正常细胞的IC₅₀仍然在10 ~ 30 μmol/L。以上结果充分证明，Gal-HAQ和Gal-AQ依赖β-半乳糖苷酶发挥细胞毒性。然而，另两个前药Gal-AQ-NO₂和Gal-HAQ-NO₂却没有展现出明显的肿瘤细胞选择性，其对正常细胞也有相似的毒性。据此推测，这两个前药在没有β-半乳糖苷酶时也会释放出部分原药。

Table  1.  Cytotoxicity of indicated compounds in OVCAR-3, HEK-293, and L-02 cells as measured by MTT assay ($\overline{\text{x}} \text{ ± } \text{s} $, n = 3)

Compd.	IC50/(μmol/L)
	OVCAR-3	HEK-293	L-02
HAQ-OH	22.0 ± 0.9	18.0 ± 1.1	9.5 ± 1.9
AQ-OH	37.7 ± 1.3	22.1 ± 0.5	17.9 ± 3.4
Gal-HAQ	23.8 ± 1.1	˃800	˃800
Gal-AQ	105.6 ± 1.5	˃800	˃800
Gal-HAQ-NO2	116.1 ± 2.3	125.5 ± 1.1	130.8 ± 2.1
Gal-AQ-NO2	175.6 ± 2.7	271.4 ± 3.1	159.8 ± 2.4

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3.2   前药稳定性测试

为了验证上述假设，以原药HAQ-OH和AQ-OH为参考，通过HPLC检测4个前药在PBS（pH 7.4, 100 mmol/L）中的稳定性。将4个前药在PBS中37 ℃条件下孵育48 h，取反应液50 μL加入甲醇50 μL溶解，离心后取上清液进HPLC检测。

HPLC条件与方法：Eclipse XDB-C₁₈高效液相色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）。流动相：水-乙腈，流速0.5 mL/min。流动相洗脱梯度：0~1 min，10%乙腈；1~4 min，10%→70%乙腈；4~9 min，70%→90%乙腈；9~10 min，90%→10%乙腈。

结果发现，前药Gal-HAQ和Gal-AQ溶于PBS中48 h后未见任何降解，而前药Gal-HAQ-NO₂和Gal-AQ-NO₂在PBS中经48 h后分别释放出约8.4%和10.1%的原药HAQ-OH和AQ-OH（图2）。因此，选择在没有β-半乳糖苷酶时更稳定的Gal-HAQ和Gal-AQ为后续研究对象。

Figure  2.  Stability of prodrugs in PBS as analyzed by HPLC

A:Stability of Gal-HAQ-NO₂ in PBS; B:Stability of Gal-AQ-NO₂ in PBS

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3.3   前药Gal-HAQ和Gal-AQ的细胞内代谢行为

按照设计思想，前药Gal-HAQ和Gal-AQ在细胞内先经酯酶水解半乳糖上的乙酰基后，转化为Gal-HAQ’和Gal-AQ’，然后再被β-半乳糖苷酶水解释放母药。首先，为了检测前药在细胞内是否生成脱乙酰基的代谢中间体，选择β-半乳糖苷酶含量较低的人肺癌细胞A-549，以防止Gal-HAQ’和Gal-AQ’进一步被β-半乳糖苷酶水解。两个前药与A-549细胞孵育24 h后通过甲醇裂解细胞，随后通过质谱检测细胞破碎提取物。结果发现，在细胞提取液中均检测到了前药脱乙酰基产物Gal-HAQ’和Gal-AQ’（图3），这在一定程度上证明了前药在细胞内首先代谢为脱乙酰基产物。

Figure  3.  Deacetylation of prodrugs Gal-HAQ’ (A)and Gal-AQ’(B) in A-549 cells as evidenced by mass spectrometry

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为了进一步分析前药Gal-HAQ和Gal-AQ能否在β-半乳糖苷酶过表达的OVCAR-3细胞中释放出原药。将OVCAR-3细胞加入50 μmol/L浓度前药的新鲜培养基，继续孵育24或48 h。使用上述同样方法破碎细胞，将破碎后的细胞离心，收集上清液后冻干，随后用甲醇20 μL溶解通过HPLC检测其中的组分。HPLC条件和方法同“3.2”项。结果表明，两个前药与OVCAR-3细胞孵育24 h后，细胞内均能检测到原药释放。因为释放的两个原药在细胞内可以通过氧化还原循环互相转化，因此于不同前药孵育的细胞内均可同时检测到HAQ-OH和AQ-OH（图4）。孵育48 h后，前药Gal-HAQ和Gal-AQ完全代谢为原药。

Figure  4.  Release of HAQ-OH (A) and AQ-OH (B) from prodrugs in OVCAR-3 cells as evidenced by HPLC

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3.4   细胞内O₂⁻生成检测

当前药在细胞内释放原药后，原药会继续在细胞内生成O₂⁻从而达到杀死细胞的目的。为了检验前药在细胞内生成O₂⁻的能力，使用O₂⁻探针：二氢乙锭（DHE），它可以与O₂⁻特异反应生成荧光产物2-羟基乙啶（2-OH-E⁺）（E_x = 480 nm, E_m = 580 nm）（图5-A）^[9]。因此，选择DHE为O₂⁻探针，利用HPLC（串联荧光检测器FLD）检测前药Gal-HAQ和Gal-AQ在OVCAR-3和HEK-293中生成O₂⁻的能力。其中培养基内DHE浓度为20 μmol/L，受试化合物浓度为100 μmol/L。HPLC图谱上的2-OH-E⁺信号峰（出峰时间12 min左右）和E⁺信号峰（出峰时间14.5 min左右）分别代表O₂⁻和其他ROS的生成。如图5-B所示，原药HAQ-OH和AQ-OH与OVCAR-3或HEK-293细胞孵育12 h后，HPLC图谱上都可明显看到代表O₂⁻生成的2-OH-E⁺信号峰。前药Gal-HAQ和Gal-AQ与过表达β-半乳糖苷酶的OVCAR-3细胞孵育12 h后，也可检测到O₂⁻的生成，但是在正常细胞HEK-293中则未检测到O₂⁻的生成。该结果进一步证明前药Gal-HAQ和Gal-AQ可经β-半乳糖苷酶激活转化为对应的蒽醌原药，并进一步释放O₂⁻。本研究进一步检测了前药Gal-HAQ和Gal-AQ与OVCAR-3细胞孵育不同时间后（6~24 h）释放O₂⁻的情况。如图5-C所示，Gal-HAQ和Gal-AQ在OVCAR-3细胞内的O₂⁻释放均呈现明显的时间依赖性。

Figure  5.  Determination of intracellular O₂⁻generation by dihydroethidium (DHE) probe

A: Principle of O₂⁻ detection by DHE; B: Generation of O₂⁻ by HAQ-OH, AQ-OH, Gal-HAQ and Gal-AQ in OVCAR-3 or HEK-293 cells after 12 h;C: Generation of O₂⁻ by Gal-HAQ and Gal-AQ in OVCAR-3 cells at different time ($\overline{\text{x}} \text{ ± } \text{s} $, n = 3)

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3.5   O₂⁻清除剂对前药Gal-HAQ和Gal-AQ影响

为了进一步证明O₂⁻对于前药Gal-HAQ和Gal-AQ的细胞毒性是至关重要的，本研究在OVCAR-3细胞与药物孵育过程中同时加入O₂⁻清除剂TEMPOL（50 μmol/L）处理^[10]，分析其对前药细胞毒性影响。如图6所示，与未加TEMPOL组比较，加入TEMPOL后，前药Gal-HAQ和Gal-AQ对细胞的毒性均显著下降（P < 0.001）。计算发现，未加TEMPOL时Gal-HAQ和Gal-AQ的IC₅₀分别为99.4 和21.7 μmol/L，而加入TEMPOL后IC₅₀均大于800 μmol/L。以上结果说明，Gal-HAQ和Gal-AQ通过O₂⁻发挥抗肿瘤活性。

Figure  6.  Effect of 2,2,6,6-tetramethylpiperidoxyl (TEMPOL) (50 μmol/L) on cytotoxicity of prodrugs in OVCAR-3 cells as analyzed by MTT assay ($\overline{\text{x}} \text{ ± } \text{s} $, n = 3)

A: Effect of TEMPOL on cytotoxicity of Gal-HAQ in OVCAR-3(^*P < 0.001 vs Gal-HAQ); B:Effect of TEMPOL on cytotoxicity of Gal-AQ in OVCAR-3(^*P < 0.001 vs Gal-AQ)

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3.6   GLUT1抑制剂对前药Gal-HAQ和Gal-AQ影响

为了探究GLUT1对糖类前药Gal-HAQ和Gal-AQ细胞毒性的贡献，采用GLUT1抑制剂根皮苷（phlorizin，1 mmol/L）预处理^[11]OVCAR-3细胞，验证其对前药IC₅₀的影响。如表2所示，与未经根皮苷处理的对照组相比，根皮苷预处理组中前药Gal-HAQ和Gal-AQ的IC₅₀分别提高了3.63倍和1.59倍，而原药HAQ-OH和AQ-OH的IC₅₀则基本不受根皮苷的影响。这些结果表明，糖类前药Gal-HAQ和Gal-AQ的细胞摄取部分依赖于GLUT1的转运，因此有可能通过Warburg效应更好地靶向过表达GLUT1的肿瘤细胞。

Table  2.  Effects of glucose transporter-1 (GLUT1) inhibitor phlorizin (1 mmol/L) on the cytotoxicity of indicated compounds in OVCAR-3 cells ($\overline{\text{x}} \text{ ± } \text{s} $, n = 3)

Compd.	IC50/(μmol/L)
	Without phlorizin	Phlorizin pretreatment
HAQ-OH	23.2 ± 0.5	25.3 ± 1.2
AQ-OH	19.5 ± 0.8	24.8 ± 1.0
Gal-HAQ	23.9 ± 1.4	86.7 ± 2.1*
Gal-AQ	105.6 ± 2.0	168.9 ± 2.6*
*P < 0.001 vs without phlorizin

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3.7   前药Gal-HAQ和Gal-AQ选择性诱导肿瘤细胞凋亡

诱导肿瘤细胞凋亡是O₂⁻发挥抗肿瘤作用的经典机制，本研究检测了前药Gal-HAQ和Gal-AQ选择性诱导肿瘤细胞凋亡的能力。通过前药对OVCAR-3细胞的活死染色实验^[12]可以看出，当前药Gal-HAQ和Gal-AQ浓度达到20 μmol/L时，死细胞（红色荧光）与活细胞（绿色荧光）的比例已明显开始上升（图7-A），所以本研究选择20 μmol/L作为凋亡检测^[7]的浓度。结果表明（图7-B），在β-半乳糖苷酶过表达的OVCAR-3中，与空白组的凋亡率（12.3%）相比，20 μmol/L的HAQ-OH、AQ-OH、Gal-HAQ和Gal-AQ处理过的细胞的凋亡率分别增长至70.4%、67.4%、67.1%和44.1%。如果在药物与OVCAR-3孵育过程中加入O₂⁻清除剂TEMPOL，HAQ-OH、AQ-OH、Gal-HAQ和Gal-AQ组的凋亡率又分别降为19.9%、9.9%、19.5%和12.8%。这证明了O₂⁻在诱导细胞凋亡中的重要作用。在β-半乳糖苷酶含量较少的A-549和HEK-293中，前药Gal-HAQ和Gal-AQ没有表现出明显的诱导细胞凋亡的能力（<10%），这进一步证明了前药通过响应β-半乳糖苷酶释放O₂⁻诱导卵巢癌OVCAR-3细胞的凋亡。

Figure  7.  Death- and apoptosis-inducing effects of Gal-HAQ and Gal-AQ

A： Cell live/death staining of Gal-HAQ and Gal-AQ in OVCAR-3 cells（scale bar: 50 μmol/L）; B：Annexin V-FITC/PI staining of apoptosis cells treated by indicated compounds (20 μmol/L)

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3.8   利用衰老细胞进一步证明前药依赖β-半乳糖苷酶发挥细胞毒性

近年来，基于衰老细胞β-半乳糖苷酶活性升高，利用β-半乳糖苷前药清除衰老细胞成为又一热点^[13]。本研究进一步考察了经β-半乳糖苷酶活化的前药Gal-HAQ和Gal-AQ是否可以用于衰老细胞的清除。正常细胞L-02的β-半乳糖苷酶活性较低，A-549虽然是肿瘤细胞但β-半乳糖苷酶活性也较低^[8]，而对应的衰老细胞株A-549/Dox和L-02/Rep的β-半乳糖苷酶活性显著升高^[14]。通过细胞毒性测试考察前药Gal-HAQ和Gal-AQ对这些细胞株的毒性。

如图8-A所示，前药Gal-HAQ和Gal-AQ对非衰老细胞A-549和L-02无明显的细胞毒性，但是可浓度依赖性地抑制衰老细胞A-549/Dox和L-02/Rep的增殖。前药Gal-HAQ在非衰老细胞A-549和L-02中，其IC₅₀均大于700 μmol/L，而在衰老细胞A-549/Dox和L-02/Rep中的IC₅₀分别为91.0和89.2 μmol/L。同样，前药Gal-AQ在非衰老细胞A-549和L-02中，其IC₅₀均大于900 μmol/L，而在衰老细胞A-549/Dox和L-02/Rep中的IC₅₀分别为112.5和165.0 μmol/L。结晶紫染色^[15]进一步证实，经两个前药处理后，衰老细胞数量显著下降，而非衰老细胞数量无明显变化（图8-B）。

Figure  8.  Effects of Gal-HAQ and Gal-AQ on non-senescent/senescent A-549 or L-02 cells

A： Cytotoxicity of Gal-HAQ and Gal-AQ in non-senescent/senescent A-549 or L-02 cells as analyzed by MTT assay ($\overline{\text{x}} \text{ ± } \text{s} $, n = 3). *P < 0.001, **P < 0.01 vs non-senescent A-549 cells; **P < 0.01, ***P < 0.05 vs non-senescent L-02 cells; B： Cytotoxicity of Gal-HAQ and Gal-AQ in non-senescent/senescent A-549 cells as revealed by crystal violet stain

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以上结果进一步证明了β-半乳糖苷酶对前药Gal-HAQ和Gal-AQ活性的重要性，也提示这两个前药除了可以选择性抑制高β-半乳糖苷酶含量的肿瘤细胞外，还可用于衰老细胞清除。

4.   结　论

提升肿瘤细胞内O₂⁻含量是抗肿瘤的有效策略。本研究以能生成O₂⁻的蒽醌类化合物HAQ-OH和AQ-OH为原药，设计并合成了4个β-半乳糖苷酶响应的β-半乳糖苷前药。研究证实，前药Gal-HAQ和Gal-AQ可在细胞内经酯酶和β-半乳糖苷酶代谢为原药，并释放O₂⁻。前药Gal-HAQ和Gal-AQ选择性地抑制过表达β-半乳糖苷酶的卵巢癌OVCAR-3细胞的增殖并诱导OVCAR-3细胞凋亡，并且它们的生物活性与原药相近。O₂⁻清除剂TEMPOL显著降低了前药Gal-HAQ和Gal-AQ对OVCAR-3细胞的毒性和诱导凋亡的能力，进一步证明了O₂⁻是前药发挥抗肿瘤作用的主要因素。最后，由于衰老细胞内β-半乳糖苷酶活性显著升高，前药Gal-HAQ和Gal-AQ可有效清除衰老细胞A-549/Dox和L-02/Rep，而不影响非衰老细胞A-549和L-02的活性。综上，Gal-HAQ和Gal-AQ有望成为新的抗肿瘤和衰老细胞清除候选药物。