地塞米松与胰岛素合用促进去甲肾上腺素合成及其释放机制研究

刘炎; 张丽结; 李珊; 傅光翊; 丁启龙

摘要: 胰岛素和地塞米松近来被证实可能在胰岛素抵抗过程中与交感神经系统兴奋有关。将以PC12细胞为研究对象，探讨地塞米松与胰岛素及两者合用对于PC12细胞去甲肾上腺素合成及释放的影响及其机制。在给予相应药物孵育24 h后，使用荧光分光光度计检测胞内游离钙离子和去甲肾上腺素含量等指标变化。胰岛素与地塞米松共同作用时，PC12细胞合成及释放的NE较两者单用有显著性上升，胞内多巴胺含量较单用胰岛素时有明显下降；α-甲基-对位酪氨酸和米非司酮可明显拮抗地塞米松在此过程中的作用；尼莫地平和肝素可分别明显阻断胰岛素和地塞米松对胞内游离钙离子的影响。结果表明：地塞米松可以与胰岛素分别通过电压门控型钙通道的IP3受体两种不同途径进一步增加PC12细胞内游离钙离子，并通过酪氨酸羟化酶、多巴胺β-羟化酶和糖皮质激素核受体途径来促进去甲肾上腺素合成及释放。

关键词:

Abstract: Several reports suggested that insulin and dexamethasone may induce the excitation of sympathetic nervous system during insulin resistance.In order to explore the effects and the mechanism on the cellular synthesis and secretion of norepinephrine (NE) of co-incubated insulin and dexamethasone，the concentrations of free Ca²⁺ and NE in PC12 cells after 24 h co-incubation with appropriate agents were detected by fluorescence spectrophotometer.It was found that co-incubation with insulin and dexamethasone increased significantly both synthesis and secretion of NE in PC12 cells when compared to the presence of insulin only.However，the synthesis of dopamine decreased significantly. This tendency was attenuated by α-methyl-tyrosine（α-MT）and mifepristone.Furthermore，nimodipine or heparin impeded the enhancement in free Ca²⁺ concentration of PC12 cells induced separately by insulin and dexamethasone.In conclusion，combination of dexamethasone and insulin may increase the concentration of free Ca²⁺ in PC12 cells independently by activating voltage-gated calcium channel and IP3 receptor，and finally facilitates the synthesis and secretion of NE in PC12 cells via tyrosine hydroxylase，dopamine β-hydroxylase and glucocorticoid nuclear receptor.

Keywords:

叶酸(N-{4-[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢-6-蝶啶)甲氨基]苯甲酰基}-L-谷氨酸)具有促进胎儿细胞分裂与氨基酸合成的作用，被广泛运用于预防孕妇贫血^[1−2]、减少新生儿先天缺陷（如神经管畸形^[3]与先天性心脏病^[4]），并有心血管保护^[5−6]和协同抗肿瘤治疗^[7−8]作用。

叶酸(图1)及其制剂已被多国药典^[9−11]收载，《欧洲药典》（EP）列出了叶酸的多种已知有关物质结构(图2)：6-羧基蝶呤（6-carboxy Pterin，CPT）、6-甲酰基蝶呤（6-formyl pterin，FPT）、6-羟甲基蝶呤（6-hydroxymethyl pterin，HPT）和谷氨酸（glutamic acid，Glu）。但是，叶酸有关物质的系统研究尚不完善，已有药品标准的有关物质均采用非挥发性流动相HPLC法检查，无法直接进行液-质联用杂质结构解析研究。

Figure 1. Typical synthetic route for folic acid

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Figure 2. Structures of folic acid known related substances

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因此，本研究建立了适用于叶酸有关物质分析鉴定的挥发性流动相LC-MS分析条件，通过高分辨Q-TOF/MS测定了叶酸及其强制降解试验样品中各有关物质母离子及其子离子的准确相对分子质量及其元素组成，并综合解析鉴定了各有关物质的结构。研究结果对叶酸的质量控制具有参考意义。

1. 材　料

1.1 试　剂

叶酸原料药（帝斯曼公司）；叶酸有关物质对照品：EP-A（Sigma-Aldrich公司）、EP-D（欧洲药品质量管理局）、CPT（加拿大Toronto Research Chemicals公司）、FPT[标准药物（中国）有限公司]、Glu（中国食品药品检定研究院）、HPT（博洛德公司）；乙酸铵、冰醋酸（AR级，南京化学试剂有限公司）；甲醇（HPLC级，德国默克公司）；去离子水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.2 仪　器

LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪、Lab-Solutions数据处理系统（日本岛津公司）、XPR10分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

2. 方　法

2.1 色谱方法

Shim-pack Scepter C18-120（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以10 mmol/L乙酸铵缓冲溶液（pH 6.3，乙酸调节）-甲醇（95∶5）为流动相A，10 mmol/L乙酸铵缓冲溶液（pH6.3，乙酸调节）-甲醇（85∶15）为流动相B，进行线性梯度洗脱（A∶B）：0 min（100∶0）→1 min（100∶0）→4.5 min（70∶30）→20 min（0∶100）→21 min（100∶0）→25 min（100∶0），检测波长280 nm，流速1.0 mL/min，柱温25℃，进样量10 µL。

2.2 质谱条件

电喷雾正离子化高分辨Q-TOF/MS测定。喷雾电压4.0 kV，雾化气流量3.0 L/min，干燥气流量10.0 L/min，接口温度300 ℃，氩气CID碰撞能量5~30 eV，扫描范围m/z 50~1000。

2.3 溶液配制

研究建立了适用于叶酸有关物质检查的挥发性流动相HPLC条件，其同时适用于有关物质的LC-MS联用鉴定。采用0.1%自身对照法计算有关物质的含量，并对含量大于0.1%的有关物质按保留时间由小到大顺序对主要有关物质进行识别和编号。

供试品溶液(1 mg/mL)：取叶酸原料药约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，用0.3%氨溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。

对照品溶液(各1 μg/mL)：取叶酸有关物质对照品各约1 mg，分别精密称定，置同一100 mL量瓶中，用0.3%氨溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取此溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用0.3%氨溶液稀释至刻度，摇匀。

强制降解试验溶液：取叶酸原料药各约10 mg，加1.0 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，于60 ℃水浴2 h；或加1 mL 3%氨试液溶解后加30%过氧化氢溶液0.5 mL，于60 ℃水浴放置1 h；或于105 ℃烘箱中放置14 d；或加0.3%氨试液5 mL，于105 ℃烘箱中放置4 d；或于光照（4500 ± 500） lx条件下放置14 d；或加0.3%氨试液5 mL，于光照（4500± 500） lx放置3 h。分别处理（碱处理溶液先中和）后，各加0.3%氨试液稀释至约10 mL(叶酸质量浓度约为1 mg/mL，氧化破坏以超纯水稀释)，作为强制降解试验的各样品溶液。由于叶酸在酸性条件下溶解性较差，故未对其进行酸性条件下的降解试验。

3. 结　果

3.1 有关物质检查

研究建立了适用于叶酸有关物质检查的挥发性流动相HPLC条件，其同时适用于有关物质的LC-MS联用鉴定。采用0.1%自身对照法计算有关物质的含量，并对含量大于0.1%的有关物质按保留时间由小到大顺序对主要有关物质进行识别和编号。

结果(表1和图3)表明，测得各降解试验样品有关物质的总量均质量平衡，所以该条件也适用于叶酸有关物质的定量检查。叶酸原料药供试品中可检出6种有关物质（2、4、5、21、22和23，图3-b）。叶酸强制降解试验表明，其对碱、氧化、光照条件均不稳定；光照干法降解形成6个主要降解产物（有关物质2、4、5、21~23，图3-c）；碱性降解形成9个主要降解产物（有关物质2、3、4、5、16、19、20、22和23，图3-d）；氧化降解形成15个主要降解产物（有关物质1~5、7~9、11、12、14、15、21、22和23，图3-e）；光照湿法降解形成11个主要降解产物（有关物质1、2、4、5、13、15、18、19、21~23，图3-f）；高温湿法降解形成6个主要降解产物（有关物质2、4、5、21~23，图3-h）；高温干法降解形成10个主要降解产物（有关物质2、4、5、6、10、13、17、21~23，图3-f）。

Table 1. Mass balance of Folic Acid and its stressed test solutions

Sample	c/(mg/mL)	Area_Imp	Area_Total	Area_Total/c	Calibration
Test sample	1.003	888198	35558327	35451971	1.00
Dry photolysis	1.032	1036933	34141675	33083018	0.98
Alkaline	1.030	4612861	36378124	35318567	1.00
Oxidation	1.022	4700314	35609756	34843205	0.98
Wet photolysis	1.020	2252711	35383000	34689216	0.93
Dry heat	1.024	3906760	34478456	33670367	0.99
Wet heat	1.012	2997786	35357191	34937936	0.95

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Figure 3. HPLC chromatograms of folic acid and its stressed test solutions

API: Folic acid; 1−17: Related substances 1−17; a: Solvent blank; b: Test sample; c: Dry photolysis; d: Alkaline; e: Oxidation; f: Wet photolysis; g: Dry heat; h: Wet heat

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3.2 有关物质的结构鉴定

根据LC-ESI-Q-TOF/MS高分辨质谱测得各有关物质的母离子及其子离子的准确质量和元素组成、反相HPLC保留与化合物极性的相关性、DAD最大吸收波长与分子中共轭结构的关联性，并通过叶酸有关物质对照品的结构特征对比分析(图4和表2)，可鉴定各主要有关物质的结构(图5)。

Figure 4. MS/MS spectra of folic acid and its major related substances [M+H]⁺ ions

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Table 2. Related substances identified in folic acid by LC-Q-TOF/MS

No.	[M+H]⁺(m/z)	Ion formula	Diff.（×10^-6）	Product ions（m/z）	UV λ_max/nm	Origins
API	442.1480	[C₁₉H₂₀N₇O₆]⁺	−2.25	313.1045，295.0941	281， 346	/
1（Glu）	148.0603	[C₅H₁₀NO₄]⁺	0.91	130.0497，102.0547，84.0447	281， 347	Dr
2（EP-A）	267.1000	[C₁₂H₁₅N₂O₅]⁺	−9.21	130.0508，120.0452	273	Dr/Pr
3	324.1223	[C₁₄H₁₈N₃O₆]⁺	−9.18	195.0781，177.0671	287	Dr
4	193.0848	[C₇H₉N₆O]⁺	−8.15	176.0580，108.0562	267， 349	Dr
5（CPT）	208.0483	[C₇H₆N₅O₃]⁺	−8.62	190.0372，180.0530，164.0524，162.0424	286， 345	Dr
6	343.1294	[C₁₈H₁₉N₂O₅]⁺	−1.61	299.1390，281.1277，253.1336，214.0865，169.0887	265	Dr
7	295.0934	[C₁₃H₁₅N₂O₆]⁺	−3.19	295.0934，176.0609，148.0391， 130.0497，84.0449	266	Dr
8	313.1036	[C₁₃H₁₇N₂O₇]⁺	−1.83	166.0498，148.0391	279	Dr
9	265.0675	[C₉H₉N₆O₄]⁺	1.81	221.0780，193.0828，178.0721，164.0560	275， 346	Dr
10	196.0469	[C₆H₆N₅O₃]⁺	−1.97	168.0519，140.0568，98.0346	279	Dr
11	279.0918	[C₁₀H₁₁N₆O₄]⁺	−6.12	261.0753，235.0968，193.0848，176.0580	274， 345	Dr
12	152.0579	[C₅H₆N₅O]⁺	−8.04	135.0311，107.0364，110.0355，82.0402	245， 273	Dr
13	152.0580	[C₅H₆N₅O]⁺	−8.70	135.0311，107.0364，110.0353，82.0402	284	Dr
14	313.0663	[C₁₂H₁₃N₂O₈]⁺	1.12	295.0559，267.0611，249.0503，166.0130，84.0438	246， 278	Dr
15	297.0744	[C₁₂H₁₃N₂O₇]⁺	−9.03	279.0640，251.0683，150.0196，84.0446	246， 274	Dr
16（HPT）	194.0689	[C₇H₈N₅O₂]⁺	−8.54	176.0580，134.0358，106.0400，81.0480	274， 346	Dr
17	137.0709	[C₇H₉N₂O]⁺	0.29	120.0441，94.0647	275	Dr
18	456.1309	[C₁₉H₁₇N₇O₇]⁺	−7.34	438.1198，327.0870，309.0760，281.0808	287， 376	Dr
19（FPT）	192.0533	[C₇H₆N₅O]⁺	−8.89	175.0255，149.0455，147.0311，122.0345，94.0400	280， 346	Dr
20	440.1317	[C₁₉H₁₈N₇O₆]⁺	−0.89	311.0885，293.0782	281， 347	Dr
21	443.1324	[C₁₉H₁₉N₆O₇]⁺	−3.23	296.0779	280	Dr
22	442.1480	[C₁₉H₂₀N₇O₆]⁺	−2.36	313.1045，295.0941	279， 346	Pr
23（EP-D）	313.1072	[C₁₄H₁₃N₆O₃]⁺	−9.08	295.0965，269.1169，176.0581，120.0453	278， 345	Dr
Pr: Process related substance；Dr: Degradation related substance

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Figure 5. Chemical structures of folic acid and its related substances 1−23

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3.2.1 已知有关物质的确证

经HPLC-ESI-Q-TOF/MS分析确证，有关物质2和23分别与药典已知杂质EP-A和EP-D相应，有关物质1、5、16和19分别与文献报道谷氨酸（Glu）、6-羧基蝶呤（CPT）、6-羟甲基蝶呤（HPT）和6-甲酰基蝶呤（FPT）相应^[12−16]。

叶酸及其已知有关物质的MS/MS裂解特征对其未知有关物质的鉴定具有参考作用。他们裂解特征(图6)包括：甲氨基桥易裂解为6-甲基蝶呤与苯甲酰-L-谷氨酸两部分；苯甲酰基-L-谷氨酸单元，易进一步脱水或脱羧生成质量数少18及少44的特征碎片离子，或谷氨酸单元成环裂解生成特征的氨基苯甲酰及谷氨酸内酰胺特征离子。

Figure 6. MS/MS Fragmentation pathways of folic acid and its typical known related substances [M+H]⁺ ions

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3.2.2 未知有关物质的鉴定

参考叶酸及其已知有关物质色谱和质谱特征，可解析鉴定各未知有关物质的结构(图5)。部分代表性未知杂质(3、8、9、10和15)结构的解析推定过程如下(其他未知有关物质均是保留了叶酸或其已知杂质较为完整结构单元的杂质，解析省略)。

有关物质3　　其为氧化及碱破坏杂质。色谱保留相对较弱与较强的极性相应，Q-TOF/MS测得其[M+H]⁺的准确质量为324.1223，与离子式[C₁₄H₁₈N₃O₆]⁺相应，与已知有关物质2的元素组成相比多个C₂H₃NO。MS/MS主要特征碎片离子m/z 195.0781([C₉H₁₁N₂O₃]⁺)和177.0671([C₉H₉N₂O₂]⁺)，与苯甲酰基-L-谷氨酸单元母离子的中性丢失L-谷氨酸及乙酰氨基相应。又有关物质3的DAD最大吸收峰与已知有关物质2相比略有红移，与苯甲酰基结构中的氨基取代相应。故推测有关物质3是在富氨基环境下氨基取代并酰胺化的杂质4-乙酰胺基-2-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸(图7)。

Figure 7. MS/MS fragmentation pathways of related substance 3 [M+H]⁺ ion

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有关物质8　　其为叶酸的特征氧化降解产物。Q-TOF/MS测得其[M+H]⁺的准确质量为313.1036，与离子式[C₁₃H₁₇N₂O₇]⁺相应，与已知有关物质2元素组成相比多CH₂O₂，其DAD最大吸收峰也与有关物质2相似，表明有关物质8与2具有相同的母核结构单元，而潜在氨基苯甲酰胺苯环的多羟基氧化特征。MS/MS主要特征碎片离子m/z 166.0498 ([C₈H₈NO₃]⁺)和148.0391([C₈H₆NO₂]⁺)分别与中性丢失了谷氨酸和进一步脱水相应，证明氧化取代在苯环。推测有关物质8是由叶酸亚甲基桥断裂并邻位氧化而生成的4-甲氨基-3,5-二羟基苯甲酰基-L-谷氨酸(图8)。

Figure 8. MS/MS fragmentation pathways of related substance 8 [M+H]⁺ ion

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有关物质9　　其为叶酸的特征氧化降解产物。Q-TOF/MS测得其[M+H]⁺的准确质量为265.0675，与离子式[C₉H₉N₆O₄]⁺相应，与已知有关物质5(CPT)元素组成相比多C₂H₃NO，其DAD最大吸收峰也与有关物质5相似，表明有关物质9与5均保留了蝶呤的母核共轭结构。MS/MS主要特征碎片离子m/z 221.0780 ([C₈H₉N₆O₂]⁺)、193.0828 ([C₈H₉N₆O₂]⁺)、178.0721 ([C₇H₈N₅O]⁺)和164.0560 ([C₆H₆N₅O]⁺)，分别与母离子脱去羧酸、醛基、进一步脱氨基或者甲基亚胺相应。推测有关物质9为2-(N-甲酰基)-6-(N-羧甲酰基)氨甲蝶呤(图9)。

Figure 9. MS/MS fragmentation pathways of related substance 9 [M+H]⁺ ion

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有关物质10　　其为叶酸高温干法破坏特征降解产物。Q-TOF/MS测得其[M+H]⁺的准确质量为196.0469，与离子式[C₆H₆N₅O₃]⁺相应，与已知有关物质16(HPT)相比，少1个CH₂多1个O元素，其DAD最大吸收峰也与HPT相似，表明有关物质10保留了HPT的蝶呤母核共轭结构，而色谱保留较弱极性增大。MS/MS主要特征碎片离子为m/z 168.0519 ([C₅H₆N₅O₂]⁺)、140.0568 ([C₄H₆N₅O]⁺) 与98.0346 ([C₃H₄N₃O]⁺)分别与[M+H]⁺中性丢失1个CO、2个CO、并进一步蝶呤母核氨基氰裂解相应。推测有关物质10为叶酸高温干法氧化降解生成的6,7-二羟基蝶呤(图10)。

Figure 10. MS/MS fragmentation pathways of related substance 10 [M+H]⁺ ion

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有关物质15　　其为叶酸的最主要的氧化降解产物。Q-TOF/MS测得其[M+H]⁺的准确质量为297.0744，与离子式[C₁₂H₁₃N₂O₇]⁺相应。与有关物质2(EP-A)相比元素组成少2个H多2个氧，其DAD最大吸收峰与EP-A相比显著蓝移共轭结构减小，表明有关物质15保留了EP-A的氨基苯甲酰基-L-谷氨酸的骨架结构，但是苯环被二氧醌化，而极性相对减小色谱保留增强。MS/MS主要特征碎片离子m/z 279.0640 ([C₁₂H₁₁N₂O₆]⁺)、251.0685 ([C₁₁H₁₁N₂O₅]⁺)、150.0196 ([C₇H₄NO₃]⁺)、84.0446 ([C₄H₆NO]⁺)分别与[M+H]⁺中性丢失H₂O、羧酸、谷氨酸、或谷氨酸内酰胺离子化相应。推测有关物质15是4-氨基-3,6-二醌甲酰基-L-谷氨酸(图11)。有关物质14与有关物质15相比，[M+H]⁺离子式[C₁₂H₁₃N₂O₈]⁺的元素组成多1个O，色谱保留更弱极性更大，DAD最大吸收峰相近，推测有关物质14是有关物质15醌环结构中进一步羟基化的杂质。

Figure 11. MS/MS fragmentation pathways of related substance 15 [M+H]⁺ ion

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4. 讨　论

研究建立的叶酸有关物质挥发性流动相HPLC检查法实现了叶酸及各有关物质的良好分离，该方法既适用于叶酸有关物质的定量检查，又满足其有关物质的色谱-质谱联用鉴定。

叶酸供试品及其强制降解试验样品在此LC-ESI-Q-TOF/MS条件下，共检测到23个主要有关物质，经鉴定其中2个为EP收载的已知杂质，4个为文献报道已知杂质，其余17个均为本研究鉴定的未知有关物质。

叶酸供试品中可检出6个有关物质(已知杂质2、5和23；未知杂质4、21和22)。强制降解试验表明，叶酸的甲氨基桥易断裂形成以蝶呤或以氨基苯甲酰胺为母核单元的有关物质；其次叶酸的苯甲酰胺键易断裂形成脱谷氨酸有关物质，氧化降解可使氨基苯甲酰胺单元生成羟基化或醌化的杂质。

HPLC-UV色谱图中有关物质19（FPT^[16]）的峰易呈鼓包状态(图3)，降低了检测灵敏度，易导致漏检；曾尝试多种流动相体系对峰形并无明显改善。升高柱温(50 ℃)其峰形有所改善。原因是FPT的结构在很宽的pH范围均具有内酰胺（酸式）与亚氨酸酯（碱式）的互变异构动态平衡^[14] (图12)，因此，叶酸有关物质检查时，宜采用较高的柱温和较强离子强度的流动相，以保障色谱峰形和检测灵敏度。

Figure 12. Acid-base isomerism of pterins

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总之，叶酸对各种影响因素条件均不稳定，相应药品的生产须注意关键制备工艺过程的控制，并建立相应的关键质量属性控制指标。

叶酸药品标准均采用非挥发性离子对流动相HPLC法检查有关物质，通过2D-LC-ESI-Q-TOF/MS检测，与本研究得到的挥发性条件下叶酸有关物质鉴定结果进行对比分析，即可实现叶酸有关物质的全面鉴定与控制。

地塞米松与胰岛素合用促进去甲肾上腺素合成及其释放机制研究

计量