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茶叶多糖对卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性的影响

茶叶多糖对卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性的影响[J]. 中国药科大学学报, 1993, (2): 122-124.
引用本文: 茶叶多糖对卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性的影响[J]. 中国药科大学学报, 1993, (2): 122-124.
Effect of Tea Polysaccharide on Lecithin-Cholesterol Acyltransferase[J]. Journal of China Pharmaceutical University, 1993, (2): 122-124.
Citation: Effect of Tea Polysaccharide on Lecithin-Cholesterol Acyltransferase[J]. Journal of China Pharmaceutical University, 1993, (2): 122-124.

茶叶多糖对卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性的影响

Effect of Tea Polysaccharide on Lecithin-Cholesterol Acyltransferase

  • 摘要: 卵磷脂胆固醇酰基转移酶(EC 2.3.1.43)简称LCAT是由肝脏微粒体合成后分泌进入血液的,其主要作用是将卵磷脂C_2位上脂酰基转移至游离胆固醇(FC)分子的3位羟基上,生成胆固醇酯(CE)和溶血卵磷脂。
    Abstract: We have investigated some effects of tea polysaccharide (TP) on LCAT. The results showed that the effects of TP on LCAT depended on apoA-I. TP has no direct effects on LCAT in the absence of apoA-I. When the amount of apoA-I is increased,the effects of TP
  • 污水分析法(wastewater analysis,WWA),又称污水流行病学(wastewater-based epidemiology, WBE)作为当前禁毒领域的“黑科技”,用于地区毒品及药物滥用情况的评估与监控,具有持续、有效、实时、便捷的特点,现已在国内外得到了广泛应用[16]。生活污水中滥用物质的监测结果作为毒情评价的一个重要指标,必须保证其数据的可靠性,以帮助不同实验室在对同一样品的鉴定获得基本一致的结论[78],即保障鉴定结论的一致性和可比性,推动城市毒品治理水平和治理能力的进一步提升。但是污水中目标物痕量、基质复杂[9],对各个实验室分析方法及仪器设备等要求较高[10],并且随着分析技术的不断发展,存在着多种多样的前处理方式及仪器分析方法,对于样品采集、样品保存和运输、实验室检测等缺乏有效的评价方法和比较、监督、规范的有效途径,不利于禁毒管理部门对数据进行分析比较。质量控制(quality control,QC)工作是指为达到质量要求所采取的有计划的作业技术和活动,是法医毒物分析的重要课题。分析方法的整个过程都需要严格的质量控制,即控制检测的各个环节、程序,使它们达到规定的要求,使得检测活动始终处于一种有效的受控状态,以保证检测结果的准确、可靠。

    本文就WWA分析过程中的主要影响因素,包括样品采集、样品保存和运输、实验室检测、毒品消耗量反算模型和实验室外部质量控制等方面进行了综述,以期探索更加全面的适合在实验室之间进行污水中毒品定性定量分析能力考察和评价的科学、客观的方法和途径,并为规范污水分析方法提供参考。

    合理的样品采集方法是证明可重复性的必要条件。影响样品采集的主要因素包括采样点的选择与布置,规范的采样方法与流程等[11]

    研究表明,采样频率的合理选择对于采样工作的准确度和整体质量有较大的影响,采样频率过高不仅会使样品之间的差异不够明显,还会影响整体工作效率,而采样频率过低可能会导致样本的非代表性,无法得出准确的实验结果[12]。采样高度对于药物浓度也有着较大影响,Fenet等[13]对卡马西平、奥马西平及其代谢物进行了研究,结果表明在30 m深采集的样本比10 m深采集的样本测得的药物浓度大,同时他们还采用了模型进行预测和模拟,结果表明在−30 m到−20 m之间药物浓度最高。虽然该方法仅研究了部分药物及其代谢物,还需要对毒品进行进一步研究,但目前研究仍可得知,保证相同的采样高度是数据可比性的必要条件。同时,对采样点位和采样时间段的科学确认[12],采样人员的职业态度、专业水平等也是采样工作中的重要影响因素[14]

    因此需要对样品的采样过程进行监督和质量控制,包括对仪器设备的校准、人员的培训和考核、采样过程的监督和审核等方面。当前我国实行的《T/SHSFJD 0001—2021生活污水采样及常见毒品检测技术规范》和《HJ 91.1—2019污水监测技术规范》中对于采样天气、采样位置等都有规定,必须严格遵守,控制交叉污染和采样误差。如,采样时应为晴或多云等无雨天气,因为如果降水量大于0.2 mm/h,混入污水中会影响到毒品的测定浓度[15];采样应在污水混合均匀的位置,如计量堰跌水处、巴歇尔量水槽喉管处等[16];采样器具可选用聚乙烯、不锈钢、聚四氟乙烯等材质,样品容器可选用硬质玻璃、聚乙烯等材质,保证在样品采集、贮存期内不会与水样发生物理化学反应,从而引起水样组分浓度的变化,此外采样器具应易于清洗,且不可与地表水、地下水等环境样品的采样器材混用等[16]

    标准中对于采样模式的选择没有硬性要求,采样模式可分为连续采样和非连续采样:非连续采样的可控性较强、能够快速收集样品,但是相较于连续采样来说,时间、采样频率等的控制均能造成较大误差;而连续采样需要经常进行维护,成本较高,不能反映滥用物质的瞬时浓度和最大值[17]。不同采样模式各有所长,应结合具体情况进行选择。其中Ort等[17]认为在24 h内使用连续流量比例法来采集样本是最佳的采样方法,能较好地代表全天的情况,保证分析结果的可靠性。欧洲污水分析核心小组(Sewage analysis CORe group Europe, SCORE)的相关研究建议采用流量或体积比例而不是时间比例的采样模式,而具体的采样频率应取决于药物流行率和集水区特征的综合情况,一般情况下采样间隔不应超过10 min[18]。采样过程中需采集全程序空白样品及现场平行样品,空白测定值一般应低于方法检出限,每批次水样至少做1份样品的现场平行样品,若测定结果差异较大,应对水样进行复核检查采样和分析过程对结果的影响。

    目前国内标准对于样品采集的大多数要求已经较为成熟,需加强监管,保证实行。

    正确的样品保存和运输可以保证数据的准确性和可靠性,确保监测结果能够真实反映毒情。污水中分析物浓度的变化主要与样品pH、温度等因素有关[19]表1总结了常见滥用物质在不同条件下的稳定性。

    表  1  滥用物质在不同条件下的降解情况
    滥用物质 稳定性 参考文献
    可替宁 在22 ℃下可以保持低于20%的转化率约3周,−20 ℃下可以保持6个月,具有高度稳定性 [22]
    3,4-亚甲二氧基苯丙胺(MDA) 在pH 7.4,19或20 ℃的条件下,未过滤的污水转化率<10%;
    在4 ℃和20 ℃下,72 h内转化率<10%;
    在 −20 ℃下,123 d内转化率<30%;
    在4 ℃下储存可稳定14 d
    [3031]
    3,4-亚甲二氧基-N-乙基安非他明(MDEA) 在pH 7.4,19 ℃的条件下,未过滤的污水转化率<10%;
    在4 ℃和20 ℃下24 h内转化率<10%;
    在−20 ℃下,123 d内降解率<20%
    [30]
    海洛因 在2 ℃和19 ℃下12 h后降解率分别为66%和79% [32]
    吗啡 在未过滤的污水中损失高达50%(19 ℃, pH 7.4);
    在−20 ℃下,3、7、17、27 d的降解率<20%;
    在4 ℃下,3 d增加>20%(其他物质的转化产物)
    [30,33]
    羟考酮 在−20 ℃下,3、7、17、27、123 d的降解率<10%;
    在 19 ℃,pH 7.4 的未过滤污水中,转化率小于 20%
    [30,32]
    芬太尼 在室温下过滤后的污水降解<10%;
    在pH 7.4,2 ℃条件下未过滤的污水72 h损失小于20%,但在19 ℃下损失62%
    [30,32]
    氯胺酮、去甲氯胺酮 在20 ℃,pH 7.5条件下未过滤的污水转化率小于10% [30]
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    在大多数地区,由于洗涤剂的使用,污水的pH是碱性的[20]。而pH会通过改变水体的理化性质和生物降解潜力,在不同的环境中推动非法药物的降解[21]。研究表明,较低的 pH 会在不同程度上抑制生物降解或化学水解,能够防止大多数目标物转化,是采样后保存的可行解决方案[22]。当污水中的药物以生物降解为主时,酸性条件对微生物活性的抑制作用更大;当吸附是主要因素时,药物容易发生质子化,减小药物与酸性溶液中其他离子的相互作用[19, 2324]。Li等[23]研究表明,低pH水平有效地减弱了下水道中大多数生物标志物的降解,特别是对不稳定化合物,如可卡因,美沙酮和尼古丁等,能够减少10%到30%,而可待因和扑热息痛的降解有一定程度的增强。由此可知,pH对于监测结果具有较大影响。

    一般来说,药物稳定性会随着温度的升高而降低。在低温条件下,微生物的活性较低,药物的损失主要是由悬浮物吸附造成。而温度升高时,污水中微生物的活性增加,降解成为主导 [2526],这也预示着污水中药物稳定性的季节性差异[25]。研究表明,在−20 ˚C下储存污水样品可确保大多数非法药物生物标志物的稳定性至少3周[27],即合适的保存温度能够提升药物的稳定性,使得检测结果更加准确。

    下水道是一个具有丰富微生物的生物膜的反应器,可能会发生各种化学、物理和生物反应。因此,在计算用量时,不仅要考虑污水中药物的稳定性,还要考虑下水道中药物的稳定性。Lin等[19]对二甲双胍、格列吡嗪等14种药物在不同类型的下水道中的降解百分比进行了研究,结果表明降解程度最高的是有生物膜的好氧和厌氧下水道,其次是没有生物膜的对照下水道,最低的是污水。总的来说,生物膜能够加速药物的降解,应考虑由此引起的浓度降低的可能。

    此外,样品保存和运输容器也会影响分析物的浓度,标准中建议采用硬质玻璃、聚乙烯等具有良好化学稳定性的材质[16]。研究表明在室温下储存时,亲脂性合成大麻素可能会吸附在聚丙烯容器表面,导致相当大的药物损失[28]。此外,还有研究比较了聚苯乙烯塑料瓶和玻璃瓶对在−20 ℃下储存 4~24 周的含THC全血样本的效果,结果表明,在塑料容器中储存的样本THC浓度损失为 60%~100%,而在玻璃瓶中的损失为 30%~50%[29]。但是目前对于污水分析中毒品保存和运输容器的研究较为缺乏,需要进行进一步研究。

    因此,需要根据目标物的性质制定合适的样品保存、运输和接收与处理规范,如样品保存容器、样品保存条件、样品运输温度等,同时对样品标识、运输记录、接收检查等操作进行统一,以保证采样数据的准确性和可靠性[11]。如,采样后污水样品是否调节 pH 由样品前处理方法及检测目标物决定,若需要酸化则使用2 mol/L 盐酸溶液进行滴加并用 pH 试纸测试,直至pH小于2。之后将样品在≤−20 ℃条件下冷冻、避光保存并尽快送往实验室分析[15]。但是当前国内标准仅为对常规毒品的规定,需适应流行趋势,加强对其余滥用物质的研究。

    样品前处理及分析方法是实验室检测环节中的关键步骤,质量控制手段可以控制实验室分析人员的分析误差,保证测试结果的精密度和准确度达到规定的质量要求。

    目前污水分析中样品前处理方法包括固相萃取法[2, 3436]、液液萃取法[3738]、微萃取[39]、新材料富集痕量毒品[4041]和直接进样法[10, 42]等,其中固相萃取是目前最常用的生活污水前处理方法[43]。Wang等[36]测定了甲基苯丙胺等13种常规滥用物质,同时采用离线固相萃取法和在线固相萃取法对33个污水处理厂的样本的定量结果进行了对比,其中,两种方法检出情况相同,差异百分比在 −19.91% 和 −20.44%之间,处于可接受范围。Ren等[10]开发了一种基于直接进样法直接测定污水中11种常规滥用物质及代谢物的LC-MS/MS法,该方法目标物与Yuan等[35]采用固相萃取法监测的目标物质相同。随后,Yuan等[44]采用上述两种前处理方法对3个添加样品及15个实际样品进行定量检测,检出情况相同,定量结果的差异百分比在 −13.76%和14.00%之间,处于可接受范围。由此可得,在线固相萃取法、离线固相萃取法和直接进样法对于上述11种物质的实验结果无明显影响,但是由于前处理方法的多样性,还需对其余方法进行进一步研究。液相色谱与质谱联用技术具有较高的灵敏度、较好的噪声消除能力和检测稳定性等优点,是目前污水中毒品检测的主要方法[2, 9, 3536]。此外,气相色谱与质谱联用、微液相色谱与质谱联用[45]、超高效超临界流体色谱与质谱联用[37]、液相色谱与高分辨质谱联用[40, 46]等也是分析污水的方法之一。

    目前已有文献中的实验室内质量控制方法均为方法验证,可使用程序空白和QC样品等来保证结果的准确性[4749],依据《SF/T 0063—2020 法医毒物分析方法验证通则》进行。而在方法验证过程中,提取回收率和基质效应是影响较大的指标,对于偏离较大的物质,可能会对检出限、定量限、准确度及精密度产生影响[50]。对于该影响,需要增加不同来源的空白样进行考察[50],也可通过添加氘代内标来进行校正。Borova等[51]建立了基于固相萃取法和LC-MS测定污水中10种新精神活性物质的方法,该方法中目标物绝对回收率的范围为40%~109%,其中亲脂性化合物的回收率较低,而添加氘代内标后的相对回收率均接近100%,即与目标物相似的氘代化合物可校正分析误差,得到相对准确的结果。

    对于实验室检测,应建立并完善相关的质量控制体系。这一体系应包括标准操作规程、质量控制措施和质量评估等。首先,应遵循标准物质说明书要求对其进行储存,有效期1年以上且已开封的标准物质应根据其理化性质对其进行期间核查并记录[52]。其次,应根据项目选择合适的方法,包括国家标准、行业标准、权威组织发布的方法等。对于新建立的分析方法,在应用前需要对其进行选择性、检出限、定量限、线性、准确度、精密度、提取回收率和基质效应等的方法验证[50],以证明方法的适用性,了解该方法最终数据的真实程度[53]。由于污水基质复杂,与样品制备有关的潜在分析误差和基质效应引起的误差应采用目标物对应的氘代化合物作为内标进行校正,若无目标物对应的氘代化合物,也可选择与其性质相似的氘代化合物进行校正。同时,实验室应制定仪器期间核查计划,包括周期、方法、指标、结果等,并按计划执行,做好记录[52]。为了评估长期精度和确保分析方法的高质量,每个分析系列中也应包括QC样品,以长期监控方法的性能[54]。内部质量控制可采用空白实验、盲样测试、平行样分析、加标样分析、质量控制图、人员比对、方法比对、仪器比对等中的一种或多种并记录[52]。对于定量结果,原始数值应进行适当的修约和截尾,遵循先运算后修约的原则,数字修约遵守GB/T 8170[55]。最后,对于实验室应保持环境整洁,合理划分满足不同需求的相对独立区域,配备化学安全防护、救护等设施或装备,对于实验室人员应进行相关的培训和考核[52]

    目前已有标准对常见毒品的检测规定了相关的实验室检测方法,并要求以保留时间、质谱特征碎片离子峰和相对丰度比作为定性判断依据,采用内标–工作曲线法或内标–单点校正法进行定量分析[15, 56]。然而,过去几十年来,滥用物质的种类和数量急剧增加,除传统毒品外,市场上还出现了大量新精神活性物质。因此,应及时关注当前的毒品流行现状,开发新的检测方法并不断改进现有方法,提高方法的灵敏度、特异性和可靠性,以适应不断变化的市场需求。

    毒品消耗量主要与毒品监测定量结果、污水流量、校正因子、人口数量等有关。目前人口数量的估算方法主要采用人口标志物法,基于选定的人口标志物在污水中的含量,对采样日污水处理厂所覆盖的人口数量进行计算,具有客观性的优点。水化学参数,如总磷、总氮、生物需氧量等也可用来计算污水厂服务人口数量,但是工业排放、农业活动或食物垃圾也可能影响上述参数,不适合准确估计人口数目[57]。对于人口标志物法,应对人口标志物的选择和校正因子进行质量控制。常见人口标志物有肌酸酐、5-羟基吲哚乙酸、可替宁、咖啡因和氮氨,大多排泄稳定且受环境影响较小。其中肌酸酐的排泄量在人群间存在差异且与疾病变化有关;5-羟基吲哚乙酸需要加入稳定剂Na2SO3且需要调节pH为酸性或储存在低温下;可替宁与吸烟人口比例有关,存在地区差异;咖啡因的来源较为复杂,需要消费数据;人均氨氮排放量在不同地区存在差别,在污水中含量易受工业污染影响[5859]。若需对不同地区毒品消耗情况进行准确对比,须统一标准,采用相同的人口标志物。校正因子是将污水中测定的生物标志物质量转化为人群初始消耗质量的一个重要参数[60]表2列出了部分用于反向计算的毒品/药物代谢目标分析物、排泄百分比及校正因子。查阅文献可知,可卡因与苯甲酰爱康宁的排泄百分比为30%~50%,校正因子为2.7±0.6[61]。甲基苯丙胺、MDMA、可待因等也因排泄百分比的不同而存在不同的校正因子。若不同研究采用不同的校正因子,可能会导致结果的可对比性降低,并且目前大多数排泄百分比来源于一些旧的药代动力学研究,需要对其进行更新及统一。

    表  2  用于反向计算的毒品/药物代谢目标分析物、排泄百分比及校正因子
    毒品/药物 毒品/药物代谢
    目标分析物
    排泄百分比/% 校正因子 参考文献
    可卡因 苯甲酰爱康宁 45 2.33 [62]
    苯甲酰爱康宁 35 3.1 [63]
    苯甲酰爱康宁 32.5 3.2 [64]
    可卡因 7.5 13 [64]
    甲基苯丙胺 甲基苯丙胺 43 2.3 [62]
    甲基苯丙胺 39 2.6 [63]
    甲基苯丙胺 33 4.06 [64]
    MDMA MDMA 65 1.5 [62]
    MDMA 15 6.7 [63]
    可待因 可待因 70 1.4 [64]
    可待因 63.8 1.6 [64]
    美沙酮 EDDP 25 3.28 [65]
    美沙酮 27.5 3.6 [64]
    氯胺酮 氯胺酮 3 3.3 [64]
    去甲氯胺酮 1.6 65 [64]
    海洛因 吗啡 42 3.1 [62, 65]
    大麻 THC-COOH 0.6 152 [62, 65]
    麻黄碱 麻黄碱 75 1.3 [62]
    安非他明 安非他明 30 3.3 [62]
    羟考酮 羟考酮 14 221 [64]
    吗氯贝胺 吗氯贝胺 1 100 [66]
    米氮平 米氮平 4 25 [66]
    奥匹哌醇 奥匹哌醇 10 10 [66]
    文拉法辛 文拉法辛 4.7 21 [66]
    文拉法辛 10.4 9.62 [67]
    西酞普兰 西酞普兰 20 5 [66]
    西酞普兰 38 2.63 [67]
    阿米替林 阿米替林 1 100 [66]
    丙咪嗪 丙咪嗪 5 20 [66]
    氯丙咪嗪 氯丙咪嗪 1 100 [66]
    曲马多 曲马多 30 3.3 [67]
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    为降低结果的不确定度,Castiglioni等[18]对可卡因的排泄率、给药途径、受试人数等进行综合考察,提出其消耗量反算的校正因子为3.59,Gao等[60]结合澳大利亚污水中阿替洛尔、卡马西平和萘普生的每日质量负荷及其相应的配药处方数据,评估和审查了新的校正因子分别为1.37、8.69和2.63,Zhao等[48]依据WBE数据及销售数据计算了新的阿米替林校正因子为7。对于人口估算,多参数人口模型也是估算人口数量的方法之一,该方法可以避免单一参数波动并克服单一方法估算的不确定性,从而得到比较客观准确的数据。Zhang等[68]利用设计容量法、水质参数法、生物标志物法和人均用水量法对污水处理厂的服务人口数进行推算,使用层次分析法对权重进行赋值,建立了更合理的污水处理厂服务人口数估算模型。Hou等[69]也结合了多参数人口模型对毒品的消费量或流行率进行估计,得到了较为准确的估算模型。但是,当前新精神活性物质滥用增加,形势严峻,且代谢和排泄等相关研究滞后。同时,我国现行标准中均未提及毒品消耗量反算模型,缺乏统一的研究规范,需要进行进一步的研究。

    质量控制可以通过实验室内部控制(iQC)和实验室外部(eQC)控制来实现。iQC对于人员、设施和环境、设备、材料、方法、记录和报告等都有一定的要求。eQC本质上与iQC相同,然而,相比较于单个实验室来说,它的优势在于可以进行同行比较,而且当需要了解潜在的系统误差时,实验室通常会将其作为故障排除的参考标准[7072]。目前,许多国家和国际组织使用WWA进行非法药物的检测,并定期进行能力验证,以评价实验室常规工作,评估实验室的分析水平。

    在欧洲科技合作计划的支持下,2011年起,SCORE开展了为期6年的一项全球实验室间比较研究,以确保参与全球监测活动的实验室提供可靠的数据。SCORE对来自25个国家的37个实验室分析不同基质(标准溶液、自来水和污水)中7种非法药物残留的分析进行了统计。在该过程中,各个实验室的样品采集后于−20 ℃进行保存和运输,并将样品进行了酸化,在进行定量时采用同位素进行校正。SCORE从重复实验获得的经验(如基质类型、样品条件、加标等)中发现了(预)分析问题,如 pH调整、过滤,并对特定的分析方法进行了改进,从而制定了实验室间设置和分析程序的最佳实践方案。结果表明,参与实验室提供了高质量的结果(7种目标物质中有6种的满意度大于80%),有必要持续跟进,以确保并进一步提高WWA结果的质量[73]。在该研究中,SCORE对所有这些程序相关的不确定性提供了全面的见解,并建立了关于采样、样品处理、化学分析、反算和数据报告的最佳实践方案。在随后每年在欧洲进行的污水监测活动中,对该议定书进行了修订和更新[18, 74]。旨在通过国际合作和知识交流,协调全球监测活动,以促进WWA的研究,并提高现有数据的空间和时间分辨率。

    本实验室也在定期开展上海市污水中常见毒品的质量控制活动,在进行质量控制活动之前,首先配制QC样品,并对其中吗啡、单乙酰吗啡、可待因、氯胺酮等毒品的均匀性、稳定性等进行了考察,严格按照保存及运输条件将样品分发给各个实验室进行测定。同时对各个实验室采集的实际样品进行抽查对比,对该实验室的污水检测能力进行评估,以提检测结果的可对比性。我国公安部禁毒情报技术中心也组织全国31个省区市禁毒部门分季度自行开展污检测工作,并定期从各地收集检测数据[75],从而推动城市毒品治理水平和治理能力的进一步提升。

    目前看来,有效的评价体系及监督管理制度能够提升不同实验室提供的结果的可比性。实验室间设置评估实验室绩效对于帮助实验室提高WWA结果的稳健性非常重要,可以通过结果评价及不满意结果的原因分析,提升各个实验室的分析能力,为打击涉毒违法犯罪活动提供科学有力的技术支撑。

    总的来说,样品采集、保存与运输、实验室检测、毒品消耗量反算模型、实验室间差异等均会影响污水定性定量分析结果的准确性。然而当前国内对于污水分析中毒品质量控制规范乃至质量控制的研究均较少,也没有适用于全国的监督、评价体系,并且我国水环境中毒品监测标准大多数为近期颁布,存在有效实施、规范操作等问题,应加强各个实验室之间的交流并定期进行能力验证。此外,新精神活性物质不断增加并呈现滥用趋势,应调整方案并开发新的分析方法,以整合越来越多的相关物质,生成更加完善的标准体系。同时,为减少不确定因素的影响,需要根据目标物的性质形成合适的样品保存运输及实验室检测方法,更新药物代谢动力学数据并结合多参数模型增强人口数量估算的准确性。与此同时,WWA还存在着开发便携式采样及检测设备和快速前处理装置,以应对现场追踪、减少分析时间和成本的趋势,也应对这类快检技术进行质量控制,生成相应的质量标准,这些都是实验室未来将面临的挑战。

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出版历程
  • 刊出日期:  1993-04-24

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