自新型冠状病毒（coronavirus disease 2019,COVID-19，以下简称新冠）感染疫情暴发以来，100余种依托不同技术平台的候选新冠疫苗相继问世^[1]，已上市的新冠疫苗种类涵盖灭活病毒疫苗^[2]、病毒载体疫苗^[2]、蛋白亚单位疫苗^[3]及mRNA疫苗等^[4]。不同类型疫苗因设计及作用原理差异，所诱导产生的免疫应答水平、特征及质量亦有差别，因此产生不同的保护效力。例如，新冠mRNA疫苗（美国Pfizer公司/德国BioNTech公司）、灭活疫苗（北京国药集团中国生物技术有限公司）、病毒载体疫苗（美国Janssen公司）在病毒突变前的真实世界保护效力分别为95%^[5]、79.3%^[6]和66.9%^[7]。然而，包括新冠疫苗在内的大多数抗感染疫苗产品均面临时间伴随的免疫力减弱（waning immunity）现象。临床研究显示，即使具有高保护效力的新冠mRNA疫苗，2针接种6个月后，中和抗体水平相比于峰值期下降80%^[8]。针对保护效力较弱或维持时间短的疫苗品种，如何进一步合理改造或应用以提高其效力是需要解决的关键问题。此外，当前使用的新冠疫苗多数基于原始病毒株开发，随着具有更高传播力和/或致病力且获得免疫逃逸能力的病毒突变株不断出现，导致现有疫苗的免疫保护效力下降^[9]。例如，接种2剂新冠mRNA疫苗（美国Pfizer公司/德国BioNTech公司）的受试者血清针对Omicron（B.1.1.529）突变株的中和能力仅为针对原始病毒株的1/30^[10]。而在南非的疫苗接种保护力数据显示，该疫苗在Omicron突变株流行期间产生的保护效力仅为70%，远低于Omicron株流行前93%^[11]。

针对以上问题，全球在围绕迭代疫苗开发^[12]、扩大产能、提高接种率、实现分配平衡等方面不断努力的同时，也针对不同的免疫接种策略进行探索和实践。其中，新冠疫苗的异源加强接种（heterologous boost vaccination），在临床上被证实相比于同种疫苗加强接种能够诱导产生更高水平的抗体和细胞免疫应答^[13−14]。例如，灭活新冠疫苗（CoronaVac，北京科兴生物制品有限公司）接种后使用重组腺病毒载体新冠疫苗（Ad5-nCoV，天津康希诺生物股份公司）进行加强接种，受试者血清病毒结合抗体和中和抗体滴度显著提高^[14]。然而，Ad5-nCoV的临床接种途径存在传统肌肉注射给药和雾化吸入式给药两种方式^[15]，该款疫苗在异源加强接种应用中，选择何种注射途径且不同注射途径所产生的疫苗特异性免疫应答反应存在何种差异，目前罕有报道。本研究系统对比分析了 “2针灭活新冠疫苗+1针灭活新冠疫苗”同源加强接种（3×INA）、“2针灭活新冠疫苗+1针Ad5-nCoV肌肉注射”[2×INA+Ad5（im）]和“2针灭活新冠疫苗+1针Ad5-nCoV滴鼻给药”[2×INA+Ad5（in）] 3组不同接种策略下，小鼠体内Spike特异性T细胞、记忆B细胞（memory B cells，MBCs)、抗体水平、抗体功能、黏膜免疫应答等关键免疫指标，为后续包括新冠疫苗在内的多种抗感染疫苗临床应用提供了预防接种策略指导。

1.   材　料

1.1   试　剂

胎牛血清（FBS）、PBS（上海龙田生物科技有限公司）；青霉素-链霉素（苏州新赛美生物科技有限公司）；双死活染料（上海睿钰生物科技有限公司）；10×PBS 溶液、ELISA包被液（10×）、红细胞裂解液、牛血清白蛋白 V（BSA）（北京索莱宝科技有限公司）；3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB） 显色液、TMB 显色终止液（上海碧云天生物技术有限公司）辣根过氧化物酶（HRP）偶联山羊抗鼠IgG（英国Abcam公司）；重组 SARS-CoV-2 S1+S2 结构域蛋白（北京义翘神州科技股份有限公司）；HRP偶联山羊抗鼠IgG2c、HRP偶联山羊抗鼠免疫球蛋白A（IgA）、HRP偶联山羊抗鼠IgG1（美国SouthernBiotech公司）； RPMI 1640 培养液 （以色列BI公司）；小鼠IFN-γ酶联免疫斑点法（ELIspot）试剂盒、小鼠IL-2 ELISPot试剂盒（瑞典Mabtech公司）；500×细胞刺激物、FITC偶联C3抗体（美国Invivogen公司）；SARS-CoV-2 Spike肽库 （南京金斯瑞生物科技有限公司）；红色荧光微球（美国ThermoFisher公司）、生物素化Spike蛋白（美国Acro Biosystems公司）；BV421-或APC-链霉亲和素（美国Biolegend公司）；LunaStain细胞染色缓冲液、顺铂试剂、Ir-DNA插层试剂、质谱流式抗体、LunaAcq细胞采集液、SureBits元素校准珠（上海宸安生物科技有限公司）；可固定活性染料eFluor^TM 506（美国eBioscience公司）；Fc受体阻断试剂（德国Miltenyi公司）；灭活新冠疫苗KCONVAC（深圳康泰生物有限公司）；腺病毒载体新冠疫苗Ad5-nCoV（天津康希诺生物股份公司）。

1.2   仪　器

CXS31SF生物倒置显微镜（日本Olympus公司）；Countstar Rigel S2全自动荧光细胞分析仪（上海睿钰生物科技有限公司）；Multiskan MK3酶标仪（瑞士Tecan公司）； Attune NXT流式细胞仪（美国ThermoFisher公司）；Celesta-1流式细胞仪（美国BD Bioscience公司）；PB-QY012104质谱流式仪（上海宸安生物科技有限公司）。

1.3   动　物

C57BL/6J 小鼠，雌性，6周龄，18~20 g，购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008。小鼠饲养于中国药科大学新药安全评价研究中心 SPF 级动物房[实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2023-0019]。动物饲养环境温度为（22 ± 1）℃，相对湿度为40% ~ 60%，12 h/12 h明暗交替。所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》和中国药科大学伦理委员会要求进行，由中国药科大学新药安全评价研究中心实验动物管理和使用委员会的协议批准。

2.   方　法

2.1   疫苗免疫

C57BL/6J小鼠随机分为4组（n=8）：PBS组、3×INA 组、2×INA+Ad5（im）组、2×INA+Ad5（in）组。第0、14天，使用灭活新冠疫苗（0.1×人用剂量）肌肉注射免疫小鼠，第12周进行第3针加强接种。第7、21、35、91、127天，采集血清。第3次免疫后7 天，对小鼠进行安乐死，收集脾、肺等组织，制备单细胞悬液。

2.2   支气管灌洗液（bronchoalveolar bavage fluid，BALF）采集

小鼠安乐死之后，以背卧姿势固定在啮齿动物工作台上，并将其前爪伸直固定。减掉多余组织，充分暴露气管后于喉结处刺穿，将注射器插入气管内，用棉线固定，注射PBS 1000 μL后抽吸，收集BALF约 500 μL。

2.3   脾淋巴细胞分离

小鼠安乐死后，剖取脾，在70 µm滤膜上研磨，并用PBS 30 mL冲洗至离心管。在4 ℃条件下1000 r/min离心5 min；弃上清液，加入1×红细胞裂解液2 mL，将细胞重新分散并室温静置5 min，用PBS 30 mL终止裂解。在4 ℃条件下1000 r/min离心5 min，使用RPMI 1640培养基重新分散制备单细胞悬液。

2.4   肺组织细胞分离

小鼠安乐死后，于超净台中分离出肺组织，剪碎放置于6孔板中。样本于37 ℃原代培养箱中以100 U/mL Ⅰ型胶原酶消化4 h。在70 µm滤膜上研磨小鼠脾，并用PBS 30 mL冲洗至离心管。在4 ℃条件下1000 r/min离心5 min；弃去上清液，加入1×红细胞裂解液 2 mL，将细胞重新分散并室温静置5 min，用PBS 30 mL终止裂解。在4 ℃条件下1000 r/min离心5 min。使用PBS重新分散细胞，制备肺组织单细胞悬液。

2.5   抗原特异性结合抗体检测

将Spike蛋白以每孔50 ng包被入96孔强吸附板，4 ℃孵育过夜。后用浓度为0.075%吐温-20的PBS洗板。用2%BSA在30 °C封闭2 h。使用0.2%BSA梯度稀释血清，将血清稀释样本与空白孔于高吸附板中30 ℃条件下孵育2 h。使用HRP偶联山羊抗小鼠IgG抗体（1∶50000）测定IgG，在30°C条件下孵育1 h。使用TMB作为底物产生荧光，TMB磷酸终止液终止反应。在450 nm波长读取光密度（optical density，OD）。将OD高于2.1倍空白背景OD的稀释度作为终止滴度。针对anti-Spike IgA测量时，血清样本经1∶100稀释后加入96孔板中，用HRP标记山羊抗小鼠IgA抗体进行分析。

2.6   抗体介导的补体沉积（antibody dependent complement deposition，ADCD）检测

在4 ℃条件下，将生物素化抗原与微球共孵育16 h，使用5%BSA-PBS溶液洗涤，重新分散。取稀释后Spike抗原10 μL偶联微球（1∶100稀释后）加入96-U底板孔中，再取稀释后血清样本90 μL混匀（血清样本提前56 ℃灭活30 min）37 ℃共孵育形成免疫复合物。加入补体与37 ℃孵育15 min，加入C3抗体（1∶500稀释）使用流式细胞仪检测补体水平。数据使用FlowJo V.10.1进行分析。

2.7   抗体介导的中性粒细胞吞噬（antibody dependent neutrophil phagocytosis，ADNP）检测

在4 ℃条件下，将生物素化Spike抗原与微球共孵育16 h，使用0.1%BSA-PBS溶液洗涤，重新分散，取稀释后抗原10 μL偶联微球（1∶100稀释后）加入96-U底板孔中，再取稀释后血清样本90 μL混匀（血清样本提前56 ℃灭活30 min），37 ℃孵育2 h，形成免疫复合物。每孔加入效应细胞悬液（含有2×10⁴个中性粒细胞）100 μL，总体积为 200 μL，用含2%FBS培养基稀释细胞至每毫升2×10⁵ 个细胞。在37 ℃条件下孵育16 h。加入PBS洗涤，使用0.1% BSA -PBS重新分散。使用流式细胞仪检测中性粒细胞吞噬水平。数据使用FlowJo V.10.1进行分析。

2.8   抗原特异性T细胞应答检测

依照“2.3”项方法制备脾单细胞悬液，使用双死活染料浸染脾细胞后测量细胞浓度及活率，并用RPMI 1640 培养基将细胞浓度调至每毫升2×10⁶个细胞。ELISpot多孔板中每孔加入含10 %灭活血清RPMI 1640 培养基200 µL，在37 ℃条件下封闭30 min。用RPMI 1640 培养基稀释Spike肽库母液，至质量浓度为20 µg/mL。封闭结束后，弃去培养基，每孔中各加入上述脾细胞悬液100 µL。每个样本分别设置刺激孔和未刺激孔。分别向各样本的刺激孔中加入Spike肽库溶液100 µL，使肽库溶液工作量为10 µg/mL。在37 ℃，5% CO₂条件下培养18~20 h。培养结束后，使用PBS溶液清洗并稀释IFN-γ和IL-2抗体至1 µg/mL。每孔中各加入100 µL抗体溶液，37 ℃孵育2 h。孵育结束后使用PBS溶液清洗。以1∶1000比例稀释Streptavidin-ALP抗体，每孔加入ALP抗体溶液100 µL，37 ℃孵育1 h。最后向每孔中加入BCIP/NBT-plus底物溶液100 µL。室温避光反应8~10 min。待到斑点形成后，冲洗并避光晾干。读取每孔斑点数目。将刺激孔斑点数目与未刺激孔的差作为样本孔最终值。

2.9   IgG⁺ Spike⁺ MBC分析

使用流式细胞术评估脾中MBC。生物素化Spike蛋白与BV421-或APC-链霉亲和素以物质的量比4∶1结合，制备Spike探针。用Spike探针孵育细胞20 min，用可固定活性染料eFluor^TM 506染色5 min。细胞从脾、骨髓或淋巴结分离。洗涤后，用Fc受体阻断试剂和抗体混合物在4°C黑暗中孵育20 min。流式细胞术分析在BD FACSymphony A3流式仪上进行。数据使用FlowJo V.10.1进行分析。

2.10   质谱流式

用LunaStain细胞染色缓冲液洗涤细胞，先用顺铂试剂10 μL在室温下染色5 min。然后用LunaStain细胞染色缓冲液洗涤细胞，用重金属标记抗体混合物在室温下染色30 min。然后用LunaStain细胞染色缓冲液洗涤细胞两次，用Ir-DNA插层试剂染色10 min。染色后，在LunaAcq细胞采集液和SureBits元素校准珠20 μL中洗涤细胞并调整至每毫升1×10⁶个细胞。细胞采集后使用PB-QY012104质谱流式仪进行分析。数据使用FlowJo V.10.1进行分析。

2.11   统计方法

实验数据使用Graphpad Prism 8软件进行t-test检验分析，P<0.05被认为具有统计学意义。

3.   结　果

3.1   在不同新冠疫苗加强接种条件下对小鼠体内抗体应答分析

如图1-A所示，在第0、14天，首先对C57BL/6J小鼠肌肉注射灭活新冠疫苗或者PBS对照溶液。有研究表明在接种两针灭活疫苗约4个月之后，抗体水平有明显下降趋势^[16]，因此选择在全实验流程第155天，对小鼠进行第3针加强疫苗接种或注射PBS作为对照。第3针加强接种分别采用灭活新冠疫苗（同源加强）、Ad5-nCoV肌注（异源加强）、Ad5-nCoV滴鼻（异源加强）3种形式，对应组别分别为：PBS组、3×INA 组、2×INA+Ad5（im）组、2×INA+Ad5（in）组。伴随试验周期，对小鼠血清抗体水平进行了监测。2针灭活新冠疫苗接种后，所有疫苗组小鼠均产生较高水平anti-Spike IgG（图1-B），使用灭活新冠疫苗或Ad5-nCoV进行第3针加强接种均能够进一步提高抗体水平，但Ad5-nCoV异源接种组小鼠体内anti-Spike IgG水平显著高于同源加强接种组（图1-B），且肌肉给药和滴鼻给药两组小鼠血清anti-Spike IgG水平相当。然而，2×INA+Ad5（in）组小鼠血清中anti-Spike IgA滴度明显高于其余疫苗组，提示Ad5-nCoV经鼻给药激发黏膜免疫应答（图1-C）。接下来，针对Spike特异性IgG抗体亚型滴度和比例进行了分析。结果显示，Ad5-nCoV异源接种组小鼠体内anti-Spike IgG1，IgG2c水平显著高于3×INA 组，但第3针加强免疫后，各组IgG2c/IgG1比例无明显差异（图1-D）。为了进一步分析黏膜部位抗体应答，采集小鼠BALF进行分析，结果显示，2×INA+Ad5（im）组和2×INA+Ad5（in）组小鼠BALF样本中anti-Spike IgG滴度显著高于3×INA 组，且2×INA+Ad5（in）组更优（图1-E）；3×INA 组和2×INA+Ad5（im）组小鼠BALF均未检测到黏膜anti-Spike IgA产生，而2×INA+Ad5（in）组5/8小鼠产生anti-Spike IgA（图1-F）。该结果进一步表明了Ad5-nCoV经鼻异源加强接种诱导黏膜免疫应答优势。

Figure  1.  Evaluation of Ab responses in mice immunized with COVID-19 vaccines ($ \bar{x}\pm s $, n=8)

A: Study design; B: Longitudinal analysis of serum anti-Spike IgG titer; C: Anti-Spike IgA titer at day 169 in serum; D: Anti-Spike IgG1 and IgG2c titers and ratio of IgG2c/IgG1 at day 35 and 169; E: Anti-Spike IgG titer in bronchoalveolar bavage fluid (BALF); F: Anti-Spike IgA titer inBALF3×PBS: 3×phosphate buffered solution; 3×INA: 2×inactivated vaccine + 1×inactivated vaccine; 2×INA+Ad5（im）: 2×inactivated vaccine + 1×Ad5-nCoV (intramuscular); 2×INA+Ad5（in）: 2×inactivated vaccine + 1×Ad5-nCoV (intranasal) ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001

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3.2   Ad5-nCoV异源加强接种显著提高抗体功能

除了抗体滴度，抗体功能与其介导的免疫保护密切相关，而抗体功能很大程度上由Fc段特征所决定^[17]。本研究分析了第3针加强免疫后2周（第169天），小鼠血清ADCD和ADNP功能。与3×INA 组相比，Ad5-nCoV异源加强接种组小鼠抗体ADCD和ADNP功能显著提升（图2-A，2-B）。其中，Ad5-nCoV经肌肉注射加强接种后对抗体ADCD和ADNP功能促进作用更为显著。

Figure  2.  Effector functions of Abs induced by COVID-19 vaccines ($ \bar{x}\pm s $, n=8)

A: Antibody dependent complement deposition (ADCD) function of Abs detected by fluorescently labeled anti-C3 Abs and median fluorescence intensities(MFIs) ; B: Antibody dependent neutrophil phagocytosis (ADNP) function of Abs determined by beads-positive primary neutrophils and phagocytic scores^*P<0.05, ^**P<0.01

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3.3   Ad5-nCoV异源加强接种诱导更强地T细胞应答

T细胞应答在抗SARS-CoV-2感染中发挥重要作用^[18]。第3针加强免疫后2周（第169 天），使用Spike肽库刺激脾淋巴细胞24 h，检测脾中IL-2与IFN-γ分泌型Spike特异性总T细胞数量。结果显示：灭活新冠疫苗3次接种诱导微弱地T细胞应答，而在2针灭活疫苗接种后使用Ad5-nCoV异源加强接种能够显著上调IL-2或IFN-γ分泌型T细胞水平（图3-A，3-B）。其中，2×INA+Ad5（im）组小鼠脾病毒特异T细胞比例明显高于2×INA+Ad5（in）组，提示Ad5-nCoV经鼻腔给药对于诱导全身系统性T细胞应答能力弱于经传统肌肉注射途径，但经鼻给药是否针对肺组织特异T细胞产生较强激活尚未研究。

Figure  3.  Spike-specific cytokine-secreting T cells induced by COVID-19 vaccines ($ \bar{x}\pm s $, n=8)

A-B: Splenocytes were stimulated with Spike peptides pool and the number of IL-2 or IFN-γ-secreting T cells were quantified by ELISpot assay ^**P<0.01, ^***P<0.001

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3.4   Ad5-nCoV异源加强接种诱导Spike⁺记忆B细胞频率升高

产生高质量抗体和维持B细胞免疫记忆取决于生发中心（germinal center，GC）反应。使用荧光标记Spike蛋白作为探针对第3针免疫后小鼠脾中已发生型别转化Spike⁺MBC（CD19⁺CD38⁺IgM^-IgD^-）进行了分析。结果显示：2×INA+Ad5（im）组和2×INA+Ad5（in）组小鼠脾中Spike⁺MBCs频率显著高于3×INA 组，这一现象在Ad5-nCoV肌肉注射组更为明显（图4）。

Figure  4.  Evaluation of Spike-specific memory B cells in spleens after COVID-19 vaccination

A: Gating strategy of CD19⁺CD38⁺IgM^-IgD^- memory B cells (MBC) in spleens; B: Frequencies of Spike⁺ MBCs were quantified and shown ($ \bar{x}\pm s $, n=8) ^*P<0.05, ^**P<0.01

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3.5   Ad5-nCoV经鼻异源加强接种促进天然免疫细胞群体对肺组织浸润

相比于传统肌肉接种途径，疫苗经鼻递送可以显著激发黏膜免疫应答。采用质谱流式技术，对第3针加强接种后小鼠肺组织中免疫细胞群体构成进行了分析。由于PBS对照组小鼠体内分离提取所得肺组织单细胞数量较少，无法进行后续质谱流式分析，故研究重点聚焦3组疫苗接种组，分析对象包括中性粒细胞（CD11b⁺CD170⁺Ly6G⁺）、树突状细胞（CD11b⁺MHC Ⅱ⁺）、巨噬细胞（CD11b⁺ F4/80⁺）、单核细胞（monocytes，CD11b⁺ F4/80^-）、自然杀伤细胞（CD161⁺ CD3e^-）、B淋巴细胞（CD19⁺ CD45R⁺）、γδT淋巴细胞（CD3e⁺ γδTCR⁺）、CD4⁺ T（CD3e⁺αβTCR⁺CD4 ⁺）淋巴细胞、CD8⁺ T淋巴细胞（CD3e⁺αβTCR⁺CD8⁺）等。结果显示：相比于3×INA 组，2×INA+Ad5（in）组小鼠肺中性粒细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞频率明显增加，而γδT淋巴细胞频率显著减少；2×INA+Ad5（im）组小鼠肺组织B细胞群体比例显著增加（图5）。该现象进一步表明，Ad5-nCoV经鼻给药显著激活肺组织黏膜免疫应答。

Figure  5.  Frequencies of distinct immune cell subsets in the lung compartment after COVID-19 vaccination ($ \bar{x}\pm s $, n=8) ^*P<0.05, ^**P<0.01

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4.   讨　论

大量临床试验数据表明，新冠疫苗异源加强比同源加强具有明显优势。新冠疫苗异源加强接种可以解决病毒变异导致的疫苗单一使用条件下保护效力降低的问题，尤其适用于保护效力相对较弱的疫苗品种。2022年2月19日，国家卫生健康委员会宣布部署新冠疫苗异源序贯接种，完成2剂灭活疫苗满6个月的18岁以上人群，可选择重组蛋白疫苗（ZF2001，重庆智飞生物制品有限公司）或腺病毒载体疫苗（Ad5-nCoV，天津康希诺生物科技有限公司）进行序贯加强免疫。其中，Ad5-nCoV可以选择两种不同给药途径进行接种。

本研究系统对比分析了在早期两针灭活新冠疫苗接种的基础上，使用Ad5-nCoV进行不同给药途径序贯加强接种后，机体特异性免疫应答的产生和差异。本研究发现，“灭活疫苗+重组腺病毒载体疫苗”的序贯接种组在小鼠体内诱导产生的特异性抗体和T、B淋巴细胞反应均显著优于“灭活疫苗+灭活疫苗”的同源接种组，而Ad5-nCoV在肌肉给药、滴鼻给药两种不同注射途径下对于免疫系统的调控各有优势。Ad5-nCoV经肌注给药能够产生更强的全身系统性病毒抗原特异T细胞、Spike⁺MBCs细胞应答，而经滴鼻给药能够诱导明显的肺组织特异 黏膜应答，具体表现在血清anti-Spike IgA、BALF anti-Spike IgA的产生及关键天然免疫细胞群体的肺组织浸润。值得注意的是，肺组织中保护性抗体的产生和效应细胞的浸润可以在抗病原感染过程中发挥关键早期保护作用，有效切断感染路径。此外，本研究结果显示， Ad5-nCoV滴鼻加强接种组小鼠肺组织中γδT细胞频率显著降低，该群细胞作为肺组织长期驻留的一群细胞，在抵御外来病原微生物感染过程中发挥关键作用，其频率降低的具体原因尚不可知，推测是由于其他免疫细胞向肺组织大量募集，导致了γδT频率降低而绝对数量可能并未发生变化。

抗体在抗新冠感染过程中发挥关键作用，本研究不仅关注了疫苗诱导抗体水平高低，对于抗体的关键效应功能ADNP和ADCD也做了分析。“灭活疫苗+重组腺病毒载体疫苗”的序贯接种能够明显提高抗体与天然免疫系统关键成分（补体系统、中性粒细胞等）的协同作用，进而可通过除直接中和以外的机制发挥抗病毒保护效应。此外，本研究对脾中Spike蛋白特异的已发生型别转化的MBC进行了分析，Ad5-nCoV的序贯接种明显激活该群细胞，提示生发中心的显著活化。

综上所述，本研究系统对比分析了3×INA 、2×INA+Ad5（im）、2×INA+Ad5（in）3种不同接种策略下，小鼠体内病毒特异性T细胞、记忆B细胞、抗体水平和功能、黏膜免疫应答等关键免疫特征，为后续包括新冠疫苗在内的多种抗感染疫苗临床应用提供了预防接种策略指导。